多重實時熒光定量PCR對下呼吸道感染病原體檢測分析

劉馨玉 李 萌 石璞玉 陳明偉

下呼吸道感染是呼吸科最常見的疾病，在發展中國家發病率及死亡率居高不下。細菌、真菌是其常見的病原，隨著研究的深入，非典型病原體及病毒在下呼吸道感染中的作用逐漸被人所認識[1-3]。目前臨床普遍采用直接免疫熒光法檢測抗原或間接免疫熒光法檢測抗體，但靈敏度和特異度不理想。近年來，在普通PCR技術上發展起來的多重PCR技術可以同時檢測多種病原體，實現高通量，高靈敏度，高特異度檢測，成為呼吸道病原體診斷的新方向[4-6]。本文應用多重熒光定量PCR技術檢測痰或支氣管灌洗液標本，篩查甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、腺病毒(adenovirus, ADV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus pneumonia, RSV)、副流感病毒(parainfluenza virus, PIV)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia, MP)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, CP)、肺炎軍團菌(Legionella pneumoniae, LP)8種呼吸道常見病原體核酸，同時采用間接免疫熒光法檢測患者血清中這8種病原體IgM抗體，旨在探討多重熒光定量PCR方法的優勢及臨床應用價值。

材料與方法

一、研究對象及標本采集

選取2014年1月至2017年12月收治在西安交通大學第一附屬醫院呼吸內科的210例患者，其中男性121例，女性89例，年齡18～92歲。入選標準：①符合CAP診斷標準，參照中華醫學會呼吸病學分會2006年制定的社區獲得性肺炎(communityacquiredpneumonia, CAP)診斷和治療指南[7]；②年齡>18歲。排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②活動性肺結核患者；③吸入性肺炎或阻塞性肺炎；④發病前2周有住院治療史，本次感染不能除外醫院獲得性感染者；⑤人類免疫缺陷病毒陽性患者。所有患者的痰或支氣管灌洗液細菌或真菌培養均為陰性。

二、檢測試劑

多重實時熒光定量PCR：核酸提取：采用NucliSens easy MAGTM (生物梅里埃，法國)自動化核酸提取設備。核酸提取試劑為儀器配套試劑。Bio-Rad熒光定量PCR儀，型號CFX96。核酸檢測：呼吸道病原檢測試劑盒(Fast-track diagnostics Respiratory pathogens 33，Junglinster，盧森堡)。8種呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒(國食藥監械(進)字2010第3400365號)西班牙VIRCELL公司生產。

三、實驗方法

1. MRT-PCR法： ①標本的收集：患者入院24 h內采集痰或支氣管灌洗液標本，其中深部痰165例，支氣管灌洗液45例。痰為晨起漱口深咳后留取；支氣管灌洗液為支氣管鏡吸取的支氣管分泌物。4 h內在生物安全屋中將標本中加入1 ml病毒凍存液，分裝成3份于凍存管中，-80 ℃保存；②取200 μl加入2 ml裂解液，按照設備使用要求運行提取程序，設置提取對照和內對照，核酸融于110 μl洗脫液，-80 ℃儲存備用；③取10 μl樣本核酸進行檢測，設置檢測過程的陰性對照，用熒光定量PCR儀分析；④擴增溫度條件：42 ℃，15 min/94 ℃，3 min。40 cycles of：94 ℃，8 sec/60 ℃，34 sec；⑤結果判讀：陽性結果判讀標準為具有典型“S”型擴增曲線且CT<35。陰性對照無擴增。

2. IFA法： ①標本收集：患者入院24 h內，靜脈穿刺采集血液2～3 ml，離心后取血清；②取15 μl樣本，按照試劑說明書進行操作；③結果判讀：陽性結果可觀察到不同檢測孔中抗原與抗體結合后細胞質、細胞核或細胞膜出現蘋果綠色熒光。陰性的細胞呈紅色[8]。

3. 測序: 210例標本參考有關文獻進行PCR擴增及測序驗證，操作由中國醫學科學院病原生物研究所完成。

四、統計學方法

使用Epidata3.1錄入數據，數據核實后轉換為SPSS 18.0或Excel進行統計分析，計算檢出率、靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值，差異比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MRT-PCR檢測結果

對210例住院患者進行非典型病原體及病毒檢測，結果顯示123份標本為陽性，陽性率為58.57%，其中單一感染陽性率為50.95%(107/210)，混合感染陽性率為7.62%。混合感染的樣本為MP+FluA 7例，RSV+FluA 4例，MP+FluB 2例，RSV+FluB 2例，PIV+LP 1例。

二、IFA檢測結果

對210例住院患者應用間接免疫熒光法檢測血清IgM抗體，結果顯示80份標本為陽性，陽性率38.10%，其中單一感染陽性率為33.33%(70/210)，混合感染率為4.76%。混合感染的樣本為MP+FluA 6例，MP+FluB 1例，FluA+RSV 1例，LP+PIV 1例。

三、MRT-PCR法與IFA法比較

對210例標本全部進行PCR及測序驗證，兩種方法結果一致為108例，其中陽性45例，陰性63例，一致率為51.43%。在一致的108例標本中，98例與測序結果一致，10例與測序結果不同。分析對不同病原體的特異性和敏感性，發現MRT-PCR方法對8種常見呼吸道病原體的靈敏度和特異度均在80%以上，其中RSV和CP的靈敏度和特異度均為100%；IFA法檢測CP靈敏度、特異度高，但對大部分病原體靈敏度較低，特異度較好，見表1。在兩種方法不一致的標本中，測序結果與MRT-PCR一致的有91例，67例陽性，24例陰性；測序結果與IFA一致的有7例，全部為陰性，見表2。總體而言，MRT-PCR法和IFA法檢測的靈敏度分別為94.74%和35.96%，特異性分別為84.38%和59.38%，陽性預測值為87.80%和51.25%，陰性預測值為93.10%和43.85%。靈敏度和特異度差異有統計學意義(χ2分別為65.01和22.04，P<0.05)。

表1 MRT-PCR法與IFA法檢測結果比較

注：TP，真陽性；FP，假陽性；FN，假陰性；TN，真陰性；PPV，陽性預測值；NPV，陰性預測值

表2 兩種方法不一致標本測序結果

注：“-”為未檢測到陽性結果

討 論

MRT-PCR和IFA法均是針對呼吸道病原菌的檢驗方法，MRT-PCR主要在大型實驗室開展應用，但本實驗中應用的MRT-PCR快速檢測試劑盒已在美國和歐洲用于體外診斷。IFA檢測目前已在臨床上大量應用，已有的研究多用病毒標準品或兒童上呼吸道標本對其與膠體金免疫層析法比較，對成人下呼吸道標本檢測較少，對與MRT-PCR比較研究更少[9-15]。本文中，比較了兩種方法的檢測性能，發現MRT-PCR法陽性率58.57%，與其他研究相接近[16-17]，IFA法的陽性率33.33%，略高于國外學者的研究[16-17]，MRT-PCR法檢測混合感染率為7.62%，與Beckmann等[18]的8%的混合感染率接近。兩種方法檢測的靈敏度、特異度有統計學差異，IFA法的靈敏度明顯低于MRT-PCR法，可能與下列因素有關：①機體感染后免疫系統產生抗體存在窗口期；②部分免疫缺陷或低下患者不產生抗體[19]；③部分成年人再次感染MP后檢測不到抗體[20]。在MRT-PCR檢測中，出現一些假陽性樣本，可能與結果的判讀方法有關，由于該方法是人工根據擴增曲線判讀結果，實驗中會產生一些非典型的擴增曲線，出現誤判，導致假陽性結果。而IFA法出現大量假陽性結果不能排除一些患者存在長期攜帶IgM抗體的現象，據相關報道，部分呼吸道感染患者產生的IgM抗體可持續存在1年或更長時間[21-25]。

與傳統實驗方法相比，MRT-PCR方法不但可以檢測呼吸道病毒、非典型病原體，還可以檢測細菌、真菌，病原譜覆蓋更廣且檢測性能方面優于IFA方法。由于目前MRT-PCR價格較高，可以與IFA聯合用于臨床診斷。血清學方法陰性而MRT-PCR陽性，可能為檢查時間較早，未產生抗體，或部分患者不產生抗體；血清學方法陽性而MRT-PCR陰性，應考慮既往感染，血清學存在假陽性可能。總之，在診斷病毒或非典型病原體感染時，以MRT-PCR方法作為補充，并結合臨床癥狀及治療效果，可較早的明確診斷。