外源性CGRP對ALI大鼠BALF中TNF-α、IL-1β表達的影響

聶進 唐書福 張建勇 趙建軍

【摘要】 目的：觀察外源性降鈣素基因相關肽（CGRP）對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷（ALI）大鼠肺泡灌洗液（BALF）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）表達的影響。方法：42只SD雄性大鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、CGRP對照組（CGRP組）、急性肺損傷組（ALI組，14只）和CGRP干預組（CGRP干預組，14只）四組，其中ALI組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩亞組，干預組分為CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組兩亞組，每亞組7只。ALI組按LPS 10 mg/kg于尾靜脈注射后6 h和12 h后取材;干預組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注射后1 h，再予LPS （10 mg/kg）尾靜脈注射后分別于第6小時和第12小時后取材;CGRP對照組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注后6 h取材;NS組予生理鹽水（1 ml/kg）靜脈注射后6 h取材。記錄并比較各組SD大鼠BALF細胞計數及分類計數和濕/干重比值（W/D）;HE染色觀察各組肺組織病理變化情況;ELISA法檢測各組大鼠BALF TNF-α、IL-1β的表達水平。結果：ALI組大鼠BALF細胞總數和分類計數、W/D比值、TNF-α、IL-1β的表達量均高于NS組，差異有統計學意義（P<0.05）;同時間點損傷組與干預組比較，BALF細胞分類計數、TNF-α、IL-1β的表達均增加，差異有統計學意義（P<0.05）。NS組與CGRP對照組大鼠BALF細胞總數及分類計數、TNF-α和IL-1β的表達差異無統計學意義（P>0.05）。結論：外源性CGRP可降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量，對LPS誘導的ALI大鼠具有抗炎作用。

【關鍵詞】 急性肺損傷 腫瘤壞死因子-α 白細胞介素-1β 炎癥反應

[Abstract] Objective： To observe the intervention effect of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on the expression of TNF-α and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of lipopolysaccharide （LPS） induced acute lung injury （ALI） rats. Method： Forty-two SD rats were randomly divided into 6 groups according to a random number method， 7 rats in each group. The 6 groups were listed as normal saline control group （NS group）， CGRP control group （CGRP group）， 6-hour acute lung injury group （6 h ALI group）， 12-hour acute lung injury group （12 h ALI group）， CGRP intervention 6-hour group （CGRP+6 h ALI group）， and CGRP 12-hour group （CGRP+12 h ALI group）. 6 h ALI group and 12 h ALI group were treated with LPS （10 mg/kg） via tail vein and specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. CGRP+6 h ALI group and CGRP+12 h ALI group were injected with CGRP （5 μg/kg） by tail vein and injected with LPS （10 mg/kg） after 1 h of CGRP injection， specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. After the tail vein injection of CGRP （5 μg/kg）， the specimen of CGRP group was obtained 6 hours later; after the tail vein was injected with （1 ml/kg） of normal saline， the specimen of NS group was obtained 6 hours later. After that， BALF cell counts and differential counts were performed in each group ; right upper lung tissues were used to determine the wet/dry weight ratio （W/D）; pathological changes of lung tissues in each group were observed by HE staining; ELISA was used to measure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in BALF of each group. Result： The ALI group compared with NS group ， BALF cell counts and differential counts， the wet/dry weight ratio （W/D）， the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. The ALI group compared with CGRP intervention group at the same time， BALF cell differential counts， and the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significantly differences in BALF cell counts and differential counts， the expression of TNF-α and IL-1β between NS group and CGRP group （P>0.05）. Conclusion： CGRP possesses potential protection against LPS-induced acute lung injury through its anti-inflammatory property.

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由各種肺內和肺外致病因素導致的急性彌漫性肺損傷和進而發展的急性呼吸衰竭，是臨床常見的急危重癥之一[1]。ALI/ARDS起病急、發展迅速，缺乏特異性和有效的治療手段，病死率高達40%以上[2]。目前研究表明，炎癥反應是ALI/ARDS發生發展的關鍵機制。降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種新型的抗炎介質，文獻[3]報道CGRP可減輕ALI/ARDS的炎癥反應。本研究擬予尾靜脈注射LPS的方式構建ALI大鼠模型，予外源性CGRP進行干預，通過檢測各組ALI大鼠BALF 細胞計數及分類計數、TNF-α和IL-1β表達水平，探討CGRP是否抑制TNF-α、IL-1β的表達來實現對ALI/ARDS的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體重180～220 g，重慶第三軍醫大學動物實驗中心[合格證編號為SCXK（渝）2012-0005]提供，在標準動物飼養間給予無菌食物和水飼養。將42只大鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組，7只）、CGRP對照組（CGRP組，7只）、急性肺損傷組（ALI組，14只）和干預組（CGRP干預組，14只），其中急性肺損傷組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩亞組，干預組分為CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組兩亞組，每亞組7只。

1.1.2 主要實驗試劑及藥物 脂多糖（LPS）購于美國Sigma公司，降鈣素基因相關肽（CGRP）購于Tocris公司，ELISA試劑盒購于購于美國R&D公司。

1.2 動物模型的建立

ALI組按LPS 10 mg/kg于尾靜脈注射，6 h和12 h后取材;干預組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注射，CGRP注射成功后1 h按LPS（10 mg/kg）尾靜脈注射，分別于6 h和12 h后取材;CGRP組尾靜脈注CGRP（5 μg/kg）6 h后取材;NS組尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg，6 h后取材。

1.3 指標檢測

1.3.1 BALF中性粒細胞計數 取各組SD大鼠BALF 10 μl滴于細胞計數板上，光鏡下按計數板上的細胞數目。將BALF離心后取20 μl沉淀涂片（每個標本涂2～3張），待涂片晾干后進行瑞氏-吉姆薩染色，采取單盲法在油鏡下計數200個細胞，計數各組中性粒細胞所占的百分比。

1.3.2 肺組織濕/干重比值（W/D） 用濾紙吸干右肺上葉肺組織表面血液及水分，電子天平稱量記為濕重（W），置于80 ℃恒溫箱烤48 h后稱量記為干重（D），計算濕/干重比（W/D），W/D值反映肺水腫的嚴重程度。

1.3.3 肺組織病理改變 肺組織經石蠟包埋后 ，切4 μm切片，常規HE染色，觀察肺組織病理變化。

1.3.4 ELISA法檢測BALF中TNF-α、IL-β含量 灌洗左肺收集BALF，4 ℃下3 000 r/min離心5 min，取上清，-80 ℃保存備用。ELISA法檢測BALF上清液中TNF-α、IL-β的含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作進行。

1.4 統計學處理

試驗數據通過SPSS 17.0軟件分析系統分析，計量資料以（x±s）表示。多樣本均數比較時采用單因素方差分析，方差齊者使用LSD檢驗，方差不齊者使用Dunnetts T3檢驗，以α=0.05為檢驗校正標準，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF細胞計數及分類計數

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細胞百分比多，差異有統計學意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組BALF中性粒細胞百分比低，差異有統計學意義（P<0.05）;與12 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細胞百分比低，差異有統計學意義（P<0.05）;CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細胞百分比與CGRP+6 h ALI組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 肺組織濕/干重（W/D）比值測定

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠肺組織W/D比值大，以12 h ALI組較為明顯，差異有統計學意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組肺組織W/D比值小，12 h ALI組肺組織W/D比值大，差異均有統計學意義（P<0.05）;與12 h ALI組相比較，CGRP+12h ALI組肺組織W/D比值減小，差異有統計學意義（P<0.05）;CGRP+12 h ALI組肺組織W/D比值與CGRP+6 h ALI組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 各組肺組織HE染色病理改變

參照Jin等[4]文獻中的方法進行肺損傷病理學評價。NS組大鼠肺組織細胞形態學正常，組織完整，氣管壁及肺泡壁結構清晰，黏膜完整，管腔通暢，無明顯炎癥細胞浸潤;6 h ALI組和12 h ALI組大鼠肺組織病理提示氣管及血管周圍呈現以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，肺間質中炎癥細胞浸潤明顯，黏膜充血水腫，小葉間隔增寬、增厚;CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠肺組織病理提示氣管及血管周圍出現以嗜中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，肺間質炎癥細胞浸潤;黏膜充血水腫，氣道上皮細胞及杯狀細胞腫脹，小葉間隔增寬、增厚，但較相應的ALI組減輕，見圖1。

2.4 ELISA法檢測大鼠BALF中TNF-α含量

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異均有統計學意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量少，12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異均有統計學意義（P<0.05）;與12 h ALI組相比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量少，差異有統計學意義（P<0.05）;與CGRP+6 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.5 ELISA法檢測大鼠BALF中IL-1β含量

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異有統計學意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組IL-1β含量少，12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異均有統計學意義（P<0.05）。與12 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量少，差異有統計學意義（P<0.05）。與CGRP+6 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

ALI/ARDS是由創傷、嚴重感染、中毒等多種因素導致全身炎癥反應綜合征的肺部表現，主要病理特征是炎癥反應導致的肺微血管內皮及肺泡上皮受損，微血管通透性增高，肺泡腔滲出富含蛋白的液體，進而引起肺水腫及透明膜形成，臨床表現為呼吸窘迫、難治性低氧血癥和呼吸衰竭，肺部影像學表現為雙肺彌漫性滲出性改變[5]，是目前呼吸系統急危重癥疾病研究的難點和熱點之一，但ALI/ARDS發病機制尚未安全闡明并且預后不良。

近年來，隨著對ALI/ARDS的發病機制不斷深入研究，發現炎癥細胞和炎癥介質參與的炎癥反應在ALI/ARDS的發生發展中起關鍵作用。炎癥細胞產生多種炎癥介質和細胞因子，最重要的是TNF-α、IL-1β，導致大量中性粒細胞肺內聚集、激活，并通過“呼吸暴發”釋放氧自由基、蛋白酶和炎癥介質，引起靶細胞損害，表現為肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，肺微血管通透性增高和微血栓形成，最終導致肺部彌漫性肺間質及肺泡水腫，從而引起呼吸窘迫、頑固性低氧血癥[5]。研究表明，膿毒癥是ALI/ARDS常見原因之一，膿毒癥伴發的全身嚴重炎癥反應是急性肺損傷的主要發病機制[6-7]，革蘭陰性桿菌感染是膿毒癥最常見的病因[8]，而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要組分之一，對膿毒癥的發生和發展發揮著重要的作用[9]。ALI的主要病理改變包括肺組織中炎性細胞浸潤，肺間質和肺泡出血和水腫，肺泡毛細血管屏障受損，通透性增加[10]。本研究采用10 mg/kg LPS尾靜脈注射制備大鼠ALI模型，結果顯示，ALI組大鼠各時相BALF中性粒細胞計數、W/D比值均高于NS組，并且肺組織病理切片見毛細血管明顯充血，肺泡及間質見大量中性粒細胞浸潤，肺泡腔內可見紅細胞滲出，肺泡隔增寬、紊亂，提示尾靜脈注射LPS已成功建立大鼠ALI模型。

研究表明，在炎癥反應的發生發展過程中TNF-α是始動因素，IL-1β發揮協同作用[11]。IL-1β不能直接活化白細胞，但可以引起IL-8的分泌，通過改變前炎癥介質或抗炎癥細胞因子的表達和影響組織多型核中性粒細胞聚集而促進炎癥的發展[12]。可見TNF-α、IL-1β炎癥介質在ALI發病中起著重要的作用。本研究結果顯示，ALI組大鼠各時相BALF釋放的炎癥因子TNF-α、IL-β明顯高于NS組（P<0.05），提示TNF-α和IL-1β被激活，參與炎癥的級聯式放大反應，促進ALI的發生與發展。

CGRP是由37個氨基酸組成的小分子多肽，由降鈣素基因選擇性剪切編碼后合成，參與機體多種生理和病理過程[13]。奎莉越等[14]研究顯示，CGRP干預可抑制脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺上皮細胞炎癥因子的分泌。CGRP不僅有擴張血管、減輕肺水腫，還有抗炎的作用。本研究結果顯示，CGRP干預組大鼠W/D的比值、BALF中白細胞計數、中性粒細胞百分比、TNF-α、IL-β均低于相同時間點ALI組大鼠，提示外源性CGRP可抑制LPS誘導的ALI大鼠肺組織的炎癥反應及肺水腫，對ALI具有保護作用。

綜上所述，炎癥反應是ALI/ARDS的主要發病機制之一，炎癥介質TNF-α和IL-1β的激活，參與炎癥的級聯放大效應，促進ALI/ARDS的發生與發展。本研究說明CGRP作為新型的抗炎介質，通過降低炎癥介質（TNF-α、IL-1β等）的釋放，減輕了肺臟的損傷，減輕了肺水腫，從而發揮對大鼠LPS相關ALI的保護作用。

參考文獻

[1] Thompson B T，Chambers R C， Liu K D.Acute respiratory distress syndrome[J].N Engl J Med，2017，377（19）：1904-1905.

[2] Shen Y，Song J，Wang Y，et al.M2 macrophages promote pulmonary endothelial cells regeneration in sepsis-induced acute lung injury[J].Ann Transl Med，2019，7（7）：142.

[3]黃亮，季憲飛.降鈣素基因相關肽對內毒素急性肺損傷的保護作用[J].臨床急診雜志，2004，45（4）：4-6.

[4] Jin L Y，Li C F，Zhu G F，et al.Effect of siRNA against NF-κB on sepsis-induced acute lung injury in a mouse model[J].Mol Med Rep，2014，10（2）：631-637.

[5]葛均波，徐永健，王辰.內科學[M].第9版.北京：人民衛生出版社，2018：130-134.

[6] da-Palma-Cruz M，da Silva R F，Monteiro D，et al.Photobiomodulation modulates the resolution of inflammation during acute lung injury induced by sepsis[J].Lasers Med Sci，2019，34（1）：191-199.

[7]唐甜，譚利平.炎癥反應在膿毒癥ARDS發病機制中的作用[J].重慶醫學，2017，46（15）：2146-2149.

[8] Zimmerman J J，Akhtar S R，Caldwell E，et al.Incidence and Outcomes of Pediatric Acute Lung Injury[J].Pediatrics，2009，124（1）：87-95.

[9] Gupta S，Khajuria V，Wani A，et al.Murrayanine attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation and protects mice from sepsis-associated organ failure[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2019，124（4）：351-359.

[10] Costa E L，Amato M B.The new definition for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome：is there room for improvement？[J].Cur Opin Crit Care，2013，19（1）：16-23.

[11] Kim G Y，Roh S I，Park S K，et al.Alleviation of experimental septic shock in mice by acidic polysaccharide isolated from the medicinal mushroom Phellinus linteus[J].Biol Pharm Bull，2003，26（10）：1418-1423.

[12]王雪冰.厚樸酚對急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子- α、白細胞介素 - 1β 的影響[J].中國老年學雜志，2014，12（34）：7007-7009.

[13] Amara S G，Jonas V，Rosenfeld M G，et al.Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products[J]. Nature，1982，298（5871）：240-244.

[14]奎莉越，聶文莎，袁廷運，等.降鈣素基因相關肽對LPS誘導肺上皮細胞炎癥因子的影響[J].昆明醫科大學學報，2015，36（5）：17-20.

（收稿日期：2019-07-22） （本文編輯：何玉勤）