高效液相色譜法測定不同產地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜

王景雁，馬秉智，蘭 頤，王海洋，李 棟，赫 軍，陸 進，劉 曉?

（1.中日友好醫院 藥學部，北京 100029；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；3.山東達因海洋生物制藥股份有限公司，威海 264300）

山海螺為桔梗科植物羊乳Codonopsis lanceolata（Sieb.et Zucc）Trautv 的干燥根。 味甘性溫，歸心、肺經，功能益氣養陰、解毒消腫、排膿、通乳。 用于神疲乏力、頭暈頭痛、肺癰、瘡癤腫毒、喉蛾、瘰疬、產后乳少、白帶、毒蛇咬傷[1]。 現代藥理學研究表明，山海螺具有耐缺氧和抗疲勞[2，3]及增強免疫的作用[4]，鎮靜、鎮痛、抗驚厥和提高記憶力的作用[5]，抗腫瘤作用[6]，抗炎、抗菌和鎮咳作用[7]，抗氧化[8，9]，催乳作用[10]，抗突變活性和調節血脂作用[11，12]，保肝醒酒作用[13]。筆者通過前期實驗研究發現，山海螺藥材中黨參炔苷含量很高[14]，而且同屬植物黨參也以黨參炔苷作為質控指標[15]，故本文以黨參炔苷作為質控指標，采用高效液相色譜（HPLC）法測定了13 個不同產地山海螺樣品，為山海螺的質量控制提供科學依據，現將結果報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀 （包括DAD 檢測器，四元高壓梯度泵，自動進樣器、柱溫箱，美國安捷倫公司）；Sartorius CPA225D 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DT5-3 型低速自動平衡離心機（北京時代北利離心機有限公司）；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉家興儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

山海螺樣品產地見表1，鑒定為桔梗科植物羊乳Condonopsis lanceolata （Sieb.et Zucc.）Trautv.的干燥根。 黨參炔苷對照品（中日友好醫院自制，純度≥99%），乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）；甲醇為分析純；水為高純水。

山海螺供試品由中日友好醫院門診中藥房提供（購自北京鶴延齡藥業發展有限公司，產地：河北，批號：140941）

2 方法與結果

2.1 不同產地山海螺中黨參炔苷的含量測定

2.1.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse plus C18 （4.6mm×100mm，3.5μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫50min（以乙腈比例表示），0～30min（5%～35%），30～50min（35%～100%）；流 速：1.0ml/min；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進樣量10μl。 色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取黨參炔苷對照品10.14mg，置于50ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取山海螺樣品粉末5g（河北，過六號篩），精密稱定，置于100ml 錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定質量，超聲處理30min（頻率100kHz，溫度40℃），冷卻至室溫，用甲醇補足減失的質量，離心，取上清液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至25ml，經0.45μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 空白對照品溶液的制備

精密移取甲醇50ml，置于100ml 三角瓶中，按供試品溶液的制備方法制成空白對照溶液。

2.1.5 線性關系考查分別精密移取對照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。 以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到黨參炔苷的回歸方程為y=37.067x+20.901（r=0.9999）。 結果表明，黨參炔苷質量濃度在10.1～202.0μg/ml 范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

2.1.6 其它方法學考查

圖1 HPLC 圖（1-黨參炔苷）

表1 樣品產地、含量測定及HPLC 指紋圖譜相似度分析結果（n=3）

表2 精密度、穩定性、重復性實驗結果（n=6）

表3 加樣回收率實驗結果（n=6）

表4 精密度、穩定性、重復性實驗結果（n=6）

按“2.1.1”項下色譜條件，分別考查精密度、穩定性、重復性、加樣回收率，結果分別見表2 和表3。

2.1.7 樣品含量測定

分別稱取13 個不同產地的山海螺樣品5 g （過六號篩），精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算樣品中黨參炔苷的含量，結果見表1。

2.2 不同產地山海螺HPLC 指紋圖譜

2.2.1 色譜條件

同山海螺含量測定“2.1.1 ”項下色譜條件。

2.2.2 對照品溶液的制備

同山海螺含量測定“2.1.2”項下對照品溶液的制備。

2.2.3 供試品溶液的制備

同山海螺含量測定“2.1.3”項下供試品溶液的制備。

2.2.4 其他方法學考查

取S5 號山海螺樣品，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件，分別考查精密度、穩定性、重復性，經國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A 版）進行評價，結果見表4。由結果可知，精密度、穩定性、重復性良好。

2.2.5 山海螺樣品測定

取13 個產地山海螺樣品，分別按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1 ”項下色譜條件進樣分析，記錄50mim 色譜圖。 根據樣品溶液HPLC 提供的相關參數，確定山海螺共有峰為18 個，見圖2。

2.2.6 指紋圖譜相似度計算

圖2 不同產地山海螺HPLC 指紋圖譜及對照圖譜R

將13 個樣品的色譜圖導入國家藥典委員會 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A 版），設定樣品S5 為參照圖譜，采用中位數法計算，進行數據匹配，選取“時間窗寬度”為0.1min，進行譜峰自動匹配。 結果見圖2 和表1，由結果可知，13 個樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度在0.848～0.994 范圍內。

3 討論

山海螺的質量標準研究，黃昌杰[16]、王文永[17]采用HPLC 法測定了山海螺中紫丁香苷的含量，武佳等采用HPLC 法測定了四葉參中四葉參皂苷的含量[18]，趙燕燕等采用HPLC 法測定了泰山四葉參的指紋圖譜[19]，陳恒沖[20，21]用薄層色譜（TLC）法鑒別輪葉黨參藥材，以高效液相色譜（HPLC）法測定藥材中輪葉黨參皂苷的含量；又采用高效液相色譜法測定了東北地產輪葉黨參的指紋圖譜。綜合分析，上述文獻中沒有以黨參炔苷作為質控制指標的，而且用于山海螺指紋圖譜研究的樣品產地也有限，因此，筆者將黨參炔苷作為山海螺的質控指標，采用HPLC 法測定13個不同產地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜，是很有意義的。該方法簡單，重復性好，可作為山海螺的質量控制方法，為山海螺的質量控制提供了一定的依據。 通過測定13 個不同產地山海螺中黨參炔苷的含量可知，不同產地的樣品差異較大，其中，安徽六安的含量最高，廣東茂名的含量最低，分析其原因，可能與產地、采收季節、生長年限、是否野生有關，但具體原因有待進一步研究。

供試品溶液的制備方法，本文考察了超聲法、回流法、煎煮法3 種提取方法，結果發現，超聲法與回流法、煎煮法提取效率無顯著差異，但超聲法操作簡便，可控性強，故選擇超聲提取法； 然后筆者對超聲提取時間（15、30、45min）進行了考察，結果發現，30min 和45min 提取效率無顯著性差異，均高于15min，，故選擇超聲提取時間30min；最后筆者簡單地對提取溶劑（甲醇、水）進行考察，發現甲醇的提取效率遠高于水，故選用甲醇為提取溶媒。

檢測波長的選擇，筆者考察了210nm、254nm、280nm、320nm、380nm 共5 個檢測波長，結果發現，210nm 時山海螺HPLC 色譜圖中各色譜峰面積較大且分離度良好，故檢測波長選擇210nm。