響應(yīng)面法優(yōu)化菌種Acinetobacter gerneri CLX-6降解苯胺印染廢水

蔡 莉，王 敏

（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化紡系，江蘇江陰 214405；2.江陰市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇江陰 214431）

隨著印染技術(shù)的發(fā)展以及多元化的社會(huì)需求，豐富多彩的印染類產(chǎn)品日益深入人們的日常生活。其中，苯胺類化合物作為印染過程中的重要中間體，應(yīng)用較廣泛[1]。由于苯胺類化合物具有水溶性強(qiáng)、難以降解、強(qiáng)致癌等特點(diǎn)，已被國(guó)家列為重點(diǎn)防控的環(huán)境污染物黑名單，各地環(huán)保部門對(duì)印染類企業(yè)排放廢水中的苯胺質(zhì)量濃度均有明確的要求（低于1 mg/L）[2-3]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前處理含苯胺的廢水主要有三種方法：物理法、化學(xué)法及生物法[4]，生物法經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，運(yùn)用日趨廣泛。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛對(duì)苯胺降解微生物開展了多方面的研究，據(jù)報(bào)道，研究人員已從環(huán)境中成功分離出了一些苯胺類降解菌，主要包括好氧菌和厭氧菌兩大類[5]，如Emtiazi G 和Satarii M 從廢水處理廠污泥曝氣池中分離出真菌鐮刀霉（Fusarium.sp）[6]。針對(duì)自篩菌種CLX-6 進(jìn)行苯胺降解特性研究，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定對(duì)苯胺降解起顯著作用的環(huán)境因素（溫度、pH、氧氣等），確定考察因素的具體數(shù)值，再通過響應(yīng)面分析法在一定水平范圍內(nèi)求出最佳降解條件，為大規(guī)模在含苯胺印染廢水中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌源與培養(yǎng)基

菌種來源：菌種Acinetobacter gerneriCLX-6 由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。培養(yǎng)基/模擬廢水母液[7]：苯胺1 g，酵母粉 4 g，玉米漿9 g，硫酸鎂2 g，氯化鈉 2 g，pH=7.0，水1 L。

1.2 苯胺檢測(cè)方法

采用N-（1-萘基）-乙二胺偶氮法測(cè)定苯胺質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算得到苯胺降解率[8]。

1.3 菌種固定化

分別采用海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉+羧甲基纖維素鈉作為固定化載體，制作菌種Acinetobacter gerneriCLX-6的固定化小球[9]。

1.4 菌種降解特性研究

分別研究溫度、pH、供氧等環(huán)境因素對(duì)菌種CLX-6 苯胺降解率的影響，最后得到菌種的單因素培養(yǎng)條件。

1.5 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)以上一系列單因素條件運(yùn)用旋轉(zhuǎn)中心復(fù)合設(shè)計(jì)法，選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著效應(yīng)的因子，得出影響Acinetobacter gerneriCLX-6 搖瓶降解苯胺的最佳工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種CLX-6降解苯胺的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同固定化方法

為保留菌種固有的催化活性，并增加菌種的重復(fù)和連續(xù)使用性，將微生物限定在凝膠的微小格子或微膠囊等有限空間內(nèi)，同時(shí)，讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來，嘗試用不同的載體固定化菌種。以游離菌作為對(duì)照，分別將海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉+羧甲基纖維素鈉（體積比1∶1）包埋制備的菌種CLX-6小球置于模擬廢水中[10]，48、72 h后分別測(cè)定苯胺的降解率，并觀察小球的變化情況，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，以游離菌為對(duì)照，通過三種不同材料固定的菌種小球?qū)Ρ桨啡コ实母叩晚樞蛞来螢楹Ｔ逅徕c+羧甲基纖維素、海藻酸鈉、羧甲基纖維素，分別為80.11%、72.86%和55.28%。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用海藻酸鈉+羧甲基纖維素固定后的菌種小球?qū)Ρ桨返慕到饴首罡撸瑫r(shí)，固定后的小球彈性和機(jī)械強(qiáng)度均較好，沒有消融現(xiàn)象；以羧甲基纖維素為固定化載體的小球苯胺降解率最低，且固定的小球有消融現(xiàn)象，粘連較多；以海藻酸鈉為固定化載體，苯胺降解率、機(jī)械強(qiáng)度、通透性等方面介于兩者之間。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇用海藻酸鈉+羧甲基纖維素作為固定化載體。

2.1.2 溫度

外在環(huán)境溫度的改變將直接影響微生物體內(nèi)的生化反應(yīng)，從而影響菌種降解苯胺的效率。因此，設(shè)置15、20、25、30 和35 ℃這五個(gè)溫度梯度來觀察菌種CLX-6對(duì)溫度的適應(yīng)性。

由圖2可知，在15～35 ℃范圍內(nèi)，菌種 CLX-6 都能較好的降解苯胺，說明該菌種具有較寬的溫度適應(yīng)范圍，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，菌種對(duì)苯胺的降解率將達(dá)到87.72%。

2.1.3 pH

自然界中微生物對(duì)環(huán)境pH 的需求不同，大多數(shù)微生物嗜中性環(huán)境，但印染污水往往偏堿性，因此，研究菌種CLX-6 對(duì)環(huán)境pH 的需求很有必要。將菌種接種于苯胺質(zhì)量濃度1 000 mg/L，設(shè)置五個(gè)pH 梯度（5、6、7、8、9）的培養(yǎng)基中，裝液量100 mL、30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定苯胺降解率，結(jié)果見圖3。

由圖 3 可知，當(dāng)環(huán)境 pH 在5～9 范圍內(nèi)變化時(shí)，苯胺均能正常降解，說明菌種CLX-6能適應(yīng)較廣的pH范圍；當(dāng)pH=7 時(shí)，苯胺降解率最佳為90.38%；當(dāng)環(huán)境pH進(jìn)一步上升，苯胺降解率基本維持穩(wěn)定，說明弱堿性環(huán)境有利于該菌體發(fā)揮降解能力。

2.1.4 裝液量

微生物對(duì)氧氣的需求是區(qū)分好氧菌和厭氧菌的條件，氧氣含量的控制將直接影響菌種的生長(zhǎng)情況和苯胺降解率。在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，主要通過控制裝液量和搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)搖瓶中氧氣的含量，本實(shí)驗(yàn)主要探討裝液量對(duì)苯胺降解率的影響。將菌種接種于苯胺質(zhì)量濃度1 000 mg/L、pH=7.0的培養(yǎng)基中，500 mL搖瓶中的裝液量不斷提高（50、100、150、200、250 mL），30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定苯胺降解率和微生物生物量，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，搖瓶中不同的裝液量將直接影響菌種CLX-6的生物量和苯胺降解率。當(dāng)培養(yǎng)基裝液量為200 mL 和250 mL 時(shí)，苯胺的降解率分別為35.43%和14.72%，吸光度分別為0.216 和0.138；當(dāng)培養(yǎng)基裝液量為50 mL 和100 mL 時(shí)，苯胺的降解率為72.49%和90.22%，吸光度為0.364 和0.569；當(dāng)裝液量為150 mL 時(shí)，苯胺的降解率和吸光度分別達(dá)到92.19%和0.583。因此，菌種CLX-6屬于微好氧型微生物。

2.2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Acinetobacter gerneri CLX-6降解苯胺培養(yǎng)條件

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響Acinetobacter gerneriCLX-6 降解苯胺顯著影響因子為溫度、pH、裝液量，以此3個(gè)因子為自變量，以苯胺降解率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)，各因子的實(shí)驗(yàn)水平及編碼值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

將表2數(shù)據(jù)利用Statistica 8.0 軟件進(jìn)行回歸擬合分析，獲得了CLX-6降解苯胺對(duì)溫度、pH、裝液量的多元回歸方程為：Y=12.119 3X1-9.287 4X12+51.527 6X2-13.0628X22-3.2714X3-1.2287X32+1.6976X1X2+1.4384X1X3-1.432 3X2X3+73.325 9。

由表 3 可知，模型顯著（F回歸=86.23＞F0.05，P＜0.05），失擬項(xiàng)（P=0.102 46＞0.05），失擬性檢驗(yàn)不顯著，說明該回歸模型在所研究回歸區(qū)域擬合得很好。R2=96.58%，表明模型可用來解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)軟件分析結(jié)果得到各因素最佳值，擬合方程得到最佳值如表4。

表3 回歸模型方差分析表

表4 擬合方程擬合后的極值

運(yùn)用Statistica 8.0軟件做出各影響因子之間相互作用與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值的等高線和響應(yīng)面圖，具體見圖5～7。

比較苯胺降解率回歸方程的解，各因素的取值基本相近，為實(shí)驗(yàn)操作的方便，確定環(huán)境溫度33 ℃、pH=6.0、裝液量180 mL，通過三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明模型可靠性，得出苯胺降解率分別為96.67%、96.75%、96.29%。由結(jié)果可知，實(shí)際測(cè)定結(jié)果較預(yù)測(cè)值略低，但也證明了模型有效性，存在極大值點(diǎn)，具有指導(dǎo)意義。

2.3 實(shí)際印染廢水處理效果

為驗(yàn)證優(yōu)化菌種CLX-6 降解苯胺的效果，取含苯胺印染廢水為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在優(yōu)化培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度 33 ℃、培養(yǎng) pH=6.0、裝液量 180 mL）下，72 h 后取樣觀測(cè)固定化后菌種CLX-6使用頻率對(duì)苯胺降解率的影響。由表5可知，固定化菌種CLX-6連續(xù)使用四次后，苯胺降解率仍能達(dá)到92.18%，但第五次使用效果不理想，僅為84.62%，且固定化小球出現(xiàn)部分粘連現(xiàn)象，彈性變差，個(gè)別小球出現(xiàn)擠壓變形、破裂。因此，固定化后的小球在使用過程中穩(wěn)定性提高，重復(fù)使用四次后，苯胺降解率仍可以達(dá)到92.18%，該特性適合在實(shí)際處理含苯胺的廢水中使用。

表5 固定化菌種CLX-6使用頻率對(duì)苯胺降解率的影響

3 結(jié)論

菌種最合適的固定化載體為海藻酸鈉+羧甲基纖維素，溫度30 ℃，培養(yǎng)pH=7.0、裝液量150 mL 時(shí)，菌體對(duì)苯胺的降解率為92.19%；以單因素結(jié)果為基礎(chǔ)，借助于響應(yīng)面分析法優(yōu)化降解條件，優(yōu)化后的條件為：培養(yǎng)溫度33 ℃、培養(yǎng)pH=6.0、裝液量180 mL，在上述最佳培養(yǎng)條件下苯胺降解率可達(dá)96.7%。驗(yàn)證了固定化菌株CLX-6對(duì)苯胺降解的有效性和重復(fù)利用率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株適于在苯胺廢水處理時(shí)推廣使用。