量子點(diǎn)熒光免疫法在急性肺炎患兒血清白細(xì)胞介素-6檢測(cè)中的應(yīng)用

杜淑嫻

普寧市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心檢驗(yàn)科 (廣東普寧 515300)

白細(xì)胞介素-6(IL-6)是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，生物功能十分復(fù)雜[1]，其是重要的炎癥指標(biāo)，也是衡量機(jī)體炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[2]。IL-6檢測(cè)往往是監(jiān)測(cè)急性肺炎患兒炎癥反應(yīng)程度的重要項(xiàng)目，對(duì)急性肺炎患兒的臨床預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。本研究旨在探討量子點(diǎn)熒光免疫法(QDs-SA)法在急性肺炎患兒血清IL-6檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1—12月在我院呼吸內(nèi)科住院確診的急性肺炎患兒300例作為試驗(yàn)組，均符合《實(shí)用兒科學(xué)》[3]中關(guān)于急性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，全部患兒均未接種過肺炎鏈球菌疫苗，在收入住院治療前未接受相關(guān)抗生素、抗病毒及糖皮質(zhì)激素治療。其中男150例，女150例；年齡8個(gè)月至12歲，平均(4.6±1.3)歲；患兒均有發(fā)熱，且呈不規(guī)則熱，體溫>39 ℃ 84例，38～39 ℃ 32例，<38 ℃ 184例；患兒均有咳嗽，肺部聽診均呼吸音粗，68例有哮鳴，64例有濕啰音。根據(jù)血液、血清學(xué)檢測(cè)和咽分泌物培養(yǎng)將患兒分為細(xì)菌感染組(A組)、肺炎支原體感染組(B組)、病毒感染組(C組)，各100例。選取同期健康體檢兒童100名作為對(duì)照組，否認(rèn)近期消化道、血液系統(tǒng)和呼吸道等感染病史，其中男50名，女50名；年齡8個(gè)月至12歲，平均(4.7±1.4)歲。試驗(yàn)組與對(duì)照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得普寧市婦幼保健醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集

試驗(yàn)各組和對(duì)照組于治療前與治療后均常規(guī)取空腹靜脈血標(biāo)本5 ml置于生化試管，并置于35 ℃水浴箱20放置15 min血標(biāo)本，讓血標(biāo)本全部自動(dòng)凝集，接著置于離心機(jī)中以1 500 r/min離心30 min，最后提取上面血清，置于-30 ℃醫(yī)用冰箱保存待檢。

1.2.2IL-6檢測(cè)

QDs-SA測(cè)定血清標(biāo)本IL-6，檢測(cè)試劑盒由深圳市金準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供；儀器使用奧納(Olyna) 自動(dòng)化多通道干式熒光免疫分析儀，由深圳市金準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清標(biāo)本IL-6，檢測(cè)試劑盒由美國RayBiotech公司提供；儀器使用雷杜RT-6100型酶標(biāo)分析儀和雷杜RT-3100自動(dòng)洗板機(jī)，由深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司提供。所有的臨床試驗(yàn)檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 臨床評(píng)價(jià)

比較治療前后各組血清IL-6水平；分析QDs-SA和ELISA的線性關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后各組血清IL-6水平

治療前，A組血清IL-6水平高于B組、C組、對(duì)照組，B組血清IL-6水平高于C組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前，C組血清IL-6水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，A組、B組血清IL-6水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，A組、B組、C組血清IL-6水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療前后各組血清IL-6水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05；與同組治療前比較，dP<0.05

2.2 QDs-SA和ELISA的線性關(guān)系

QDs-SA和ELISA測(cè)定臨床血清標(biāo)本IL-6水平的回歸方程為Y=2.22X+2.72，決定系數(shù)R2=0.98(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩種方法檢測(cè)血清IL-6水平的曲線回歸

3 討論

IL-6是一種非常重要的炎性細(xì)胞因子，是現(xiàn)在已知的細(xì)胞因子家族中的核心成員之一，由多種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞自發(fā)或在各種因素刺激下分泌，是炎癥反應(yīng)急性期合成的重要介質(zhì)，對(duì)多種細(xì)胞有促炎作用，能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)的急性時(shí)相蛋白[4]，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，加強(qiáng)炎性細(xì)胞因子的釋放，在患兒機(jī)體內(nèi)的炎性免疫調(diào)節(jié)及自身免疫疾病的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。細(xì)菌或病毒感染、免疫復(fù)合物沉積和梗死等因素都可導(dǎo)致各類組織損傷，在各類組織損傷急性期，由多種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞合成和分泌一些炎性細(xì)胞因子，其中IL-6是炎性細(xì)胞因子中變化最顯著的一種。Yang等[5]和Chou等[6]研究證實(shí)，細(xì)菌性及支原體性肺炎患兒體內(nèi)IL-6水平較正常對(duì)照組有明顯增高(P<0.05)。有研究表明，檢測(cè)血液循環(huán)中IL-6的表達(dá)水平可以更好地用于判斷肺組織的炎性狀態(tài)[7]，本研究結(jié)果與其結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌感染及肺炎支原體感染患兒血清IL-6水平較健康體檢兒童有明顯增高(P<0.05)；健康體檢兒童血清IL-6水平較低，但在炎癥反應(yīng)或急性組織損傷后，IL-6的合成和分泌迅速增加，與炎癥反應(yīng)同步變化，在感染早期血清IL-6水平即迅速升高，升高程度與感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。經(jīng)積極治療后，IL-6迅速降至正常范圍，該種特異性的變化為臨床提供了大量的相關(guān)性診療信息；提示IL-6作為一種重要的非特異性炎癥介質(zhì)，全程參與肺部炎癥反應(yīng)病理過程。IL-6在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、抗感染及自身免疫方面起重要作用，可作為所有肺部急性感染的輔助診斷指標(biāo)。

細(xì)菌感染時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并釋放內(nèi)源性遞質(zhì)刺激淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞加速合成和分泌IL-6。支原體是一種比細(xì)菌小又比病毒大的微小微生物，缺乏細(xì)胞壁，形態(tài)上呈高度多形性，是最小的能獨(dú)立生活的原核細(xì)胞型微生物，同時(shí)又具有某些細(xì)菌的特點(diǎn)，因此同樣能刺激淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞合成和分泌包括IL-6在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子。細(xì)菌、肺炎支原體和病毒均是小兒急性呼吸道感染的主要病原體，早期鑒別病原體可避免延誤患兒病情及防止抗生素類的濫用[8]。本研究結(jié)果表明，細(xì)菌感染和肺炎支原體感染后患兒血清IL-6水平顯著升高，且細(xì)菌感染患兒血清IL-6水平遠(yuǎn)高于肺炎支原體感染患兒；病毒感染患兒則無明顯升高。因此，及時(shí)檢測(cè)血清IL-6水平可早期鑒別診斷小兒急性呼吸道感染病原體類型以便及時(shí)用藥。

目前檢測(cè)IL-6多采用ELISA法，雖然ELISA法具有比較高的特異度和靈敏度，但是ELISA法操作較復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不適宜于門急診處做單份急診檢測(cè)[9]。量子點(diǎn)又稱半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由Ⅱ～Ⅵ族元素組成的納米顆粒，其直徑在2～6 nm；近年來，量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)具有高靈敏度、實(shí)時(shí)、靶向、原位、多色、活體和多功能示蹤等特性，在實(shí)驗(yàn)室診斷中使用越來越廣泛[10]。量子點(diǎn)是最有前途的熒光標(biāo)記物之一，研究量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要臨床意義[11]。

本研究QDs-SA以交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價(jià)鍵連接的方法對(duì)抗人IL-6單克隆IgG抗體單抗進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記，量子點(diǎn)表面的羧基與EDC反應(yīng)生成酰基異脲，接著加入NHS溶液，NHS與酰基異脲生成具有胺反應(yīng)活性的NHS酯，與 IL-6的單克隆IgG抗體單抗表面的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺，從而偶聯(lián)到IL-6的單克隆IgG抗體單抗上，將其噴涂到硝酸纖維素膜(NC)基質(zhì)上面，將另一IL-6的單克隆IgG抗體配對(duì)IL-6蛋白的單克隆抗體包被在NC膜上，建立雙抗體夾心量子點(diǎn)熒光免疫法快速檢測(cè)血清IL-6蛋白。

本研究結(jié)果顯示，QDs-SA與ELISA法檢測(cè)血清IL-6水平線性關(guān)系良好，QDs-SA屬于新型的超微量檢測(cè)技術(shù)，將高靈敏的量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合，量子點(diǎn)具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，基于量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光的高靈敏免疫傳感器，在其檢測(cè)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，其檢測(cè)的下限遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA法檢測(cè)下限，QDs-SA與傳統(tǒng)的ELISA法分析技術(shù)相比，具有穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)便、靈敏和選擇性高等特點(diǎn)[12]。

綜上所述，在小兒急性呼吸道感染時(shí)，血清IL-6水平檢測(cè)有助于疾病的早期診斷；QDs-SA在急性肺炎患兒血清IL-6檢測(cè)中具有良好的分析性能，且與ELISA法高度線性相關(guān)，QDs-SA檢測(cè)性能滿足臨床上監(jiān)測(cè)急性肺炎患兒血清IL-6水平的需要。