深圳地區孕婦甲硫氨酸合成酶還原酶和亞甲基四氫葉酸還原酶的基因多態性分布

薛麗霞，賴曉燕，鄭定容

1 深圳市寶安區西鄉預防保健所 (廣東深圳 518102)；2 寶安區中心醫院社區健康服務管理中心(廣東深圳 518102)

研究表明，葉酸缺乏會擾亂正常細胞的DNA合成、修復和甲基化，使孕婦具有致癌的易感性[1]。甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是兩種重要的葉酸代謝酶，具有重要的生理功能，其基因多態性會影響體內同型半胱氨酸及葉酸的代謝水平。近年來，大量的臨床流行病學研究資料表明，MTHFR、MTRR與妊娠高血壓、復發性流產、神經管畸形和心腦血管疾病的發生有密切關系[2-3]，嚴重影響母嬰的心身健康。本研究針對深圳市地區孕婦，開展MTHFR和MTRR基因多態性的分子流行病學分析，旨在闡明本地區人群的MTHFR和MTRR基因多態性遺傳特征，為深圳市地區孕婦個體化的孕期保健提供科學依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市寶安區中心醫院2017年1月至2018年7月進行孕期檢查的孕婦2 466名作為研究對象，年齡18～45歲，平均(26.7±6.6)歲。納入標準：(1)相互間無血緣關系；(2)孕婦知情并同意本研究；(3)深圳市戶籍；(4)同意進行口腔黏膜細胞采樣。排除標準：(1)患有精神類疾病無法配合；(2)患有風濕免疫系統疾病；(3)嚴重肝腎功能不全；(4)合并有惡性腫瘤或其他惡性疾病。本研究均獲得深圳市寶安區西鄉預防保健所醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1試劑及儀器

Taq DNA聚合酶由德泰生物科技(南京)有限公司提供，dNTP由北京百奧萊博科技有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由合肥博美生物科技有限責任公司提供，10×聚合酶鏈式反應(PCR)緩沖液由上海遠慕生物科技公司提供，DNA片段長度標準物PBR322DNA/HacⅢ Makers由華美生物工程(廣州)公司提供，Hinf I限制性內切酶及其緩沖液由北京百奧萊博科技有限公司提供，其余試劑為分析純。實時熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)儀器采用美國伯樂生命醫學產品有限公司 Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀，步驟均嚴格按照說明書進行操作及判定結果。

1.2.2引物的設計及合成

參照Tsuyoshi等[4]方法設計正反及探針義鏈，內參基因為β-actin均由FAM標記，由廣州中山大學達安基因有限公司合成，MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T引物序列見表1。

表1 引物與探針序列

1.2.3PCR檢測

(1)PCR反應體系：2×緩沖液10.0 μl，10.0 μmol/L的引物P1 1.0 μl，10.0 μmol/L引物P2 1.0 μl，模板DNA 1.0 μl，雙蒸H2O 7.0 μl。PCR反應條件及循環：93 ℃變性2 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環，75 ℃延伸5 min，基因分析采用Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀自帶的基因分析應用軟件，嚴格按照說明書進行操作及判定結果，再進行各組中MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T的基因表達水平的比較。(2)質量控制：每批次均設置陰性質控和陽性質控，試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，步驟嚴格按試劑盒使用說明操作，檢測服務由中山大學達安基因股份有限公司提供。

1.2.4標本采集

采集受檢者首先用溫開水漱口，接著用醫用消毒棉簽在頰黏膜兩側輕刮多次，然后置于1.5 ml 0.9%氯化鈉注射液的離心管中，最后多次攪動棉簽讓口腔黏膜上皮細胞盡可能多地落入0.9%氯化鈉注射液中，之后用柱式抽提試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司提供)抽提DNA標本；吸取5 μl DNA標本，加水稀釋至1.0 ml，充分震蕩混勻，并應用SWB-800型微量紫外可見分光光度計(由深圳市速王科技有限公司提供)260 nm和280 nm處讀取吸光度(OD)值，測定DNA濃度/純度，滿足濃度2～20 ng/μl，純度A260/A280=1.7～2.0，儲存于DW-40L188立式醫用低溫冰箱(由青島海爾集團有限公司提供)-20 ℃備用。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，多組間比較采用行×列表資料的χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

深圳地區孕婦MTHFR C677T位點基因型純合突變TT型頻率為15.8%(390/2 466)，高于廣東省惠州[5]的10.9%，低于河南省鄭州[6]的40.7%和河北省三河市[7]的37.4%，差異有統計學意義(P<0.05)；MTHFR A1298C位點基因型純合突變CC型頻率為5.8%(143/2 466)，高于河南省鄭州[6]的1.3%和河北省三河市[7]的2.3%，低于廣東省惠州[5]的7.2%，差異有統計學意義(P<0.05)；MTRR A66G位點基因型純合突變GG型頻率為3.8%(94/2 466)，低于廣東省惠州[5]的5.6%、河北省三河市[7]的7.5%和河南省鄭州[6]的5.4%，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

廣東是我國出生缺陷高發省份之一，出生缺陷是導致圍生兒死亡的重要因素，也是影響人口素質的重要因素，出生缺陷的發生受環境、營養和遺傳因素的共同影響。

MTRR和MTHFR是葉酸代謝的關鍵酶，MTHFR介導5，10-亞甲基四氫葉酸(MTHF)轉變成5-MTHF，在MTRR及其輔酶維生素B12的催化下提供一個甲基給同型半胱氨酸(Hcy)，使之轉化成為甲硫氨酸，而自身轉換為四氫葉酸。甲硫氨酸則在ATP供能的情況下轉化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM是體內生化反應的甲基儲備物質，可以為細胞內的蛋白質和DNA甲基化反應提供原料；THF是一種還原型葉酸，是輔酶形式的葉酸的母體化合物，對正常血細胞的生成具有促進作用；當葉酸缺乏或葉酸相關的還原酶活性降低，使THF缺乏或者葉酸不能轉變為THF，無傳遞碳單位，使多種生物合成受阻，造成巨幼紅細胞性貧血。在懷孕期，葉酸代謝通路發生障礙導致Hcy不能順利轉化為甲硫氨酸，使血漿中Hcy濃度增高。Hcy是甲硫氨酸代謝產生的中間產物，Hcy可通過誘導氧化應激促進炎癥反應進程，容易引起孕婦血管內皮細胞損傷和功能異常，引起胎盤血栓性病變，導致胎兒發生神經管畸形。

MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G位點的多態性會降低酶活性，影響葉酸代謝和利用，與唇腭裂、唐氏綜合征、先天性心臟病、神經管畸形等出生缺陷，以及妊娠高血壓、復發性流產等孕期疾病密切相關。

本研究首次分析了MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G基因多態性在廣東深圳地區孕婦中的分布情況，與已報道的其他地區的數據進行比較，顯示深圳地區孕婦MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G 位點多態性與其他地區漢族女性的頻率存在差異，該種差異可能與人群對多種疾病的群體易感性有關，具有不同的遺傳分布特征。

MTHFR C677T和MTRR A66G等位基因頻率呈現南方低北方高的趨勢，與我國出生缺陷發病率南方低北方高的趨勢基本一致；MTHFR A1298C突變等位基因頻率基本上呈現北方低南方高的趨勢。MTHFR C677T的C被T取代后氨基酸發生錯譯，位于催化區域的丙氨酸被纈氨酸代替會導致MTHFR的熱穩定性和酶活性下降22%，MTHFR C677T的CT型和MTHFR A1298C的AC型存在協同作用，它們會導致對應的MTHFR酶活性下降到正常的36%，嚴重影響葉酸在體內的有效利用；MTRR A66G的A被G取代后氨基酸發生錯譯，位于催化區域的蘇氨酸被丙氨酸取代導致MTRR的熱穩定性和酶活性下降，從而引起葉酸和甲硫氨酸代謝障礙，最終造成葉酸吸收的下降及Hcy在人體內蓄積，MTRR A66G基因多態性導致神經管畸形風險增加2.6倍；如果在懷孕期間給孕婦補充葉酸，能夠將先天性心臟病、神經管缺陷和唇腭裂發生率降低至少60%。

綜上所述，深圳地區孕婦的MTHFR和MTRR基因多態性分布特征存在差異，通過對深圳地區孕婦進行遺傳篩查，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風險人群，給予葉酸補充干預，更合理地指導孕婦增補葉酸，是有效達到出生缺陷及孕期疾病一級預防目的的重要方法。

表2 不同地區MTRR A66G和 MTHFR A1298C、C677T基因型分布比較[名(%)]