一株有機磷農藥降解菌的篩選

一、材料與方法

（一）試驗材料

1.藥品。40%辛硫磷乳油，江蘇寶靈化工股份有限公司生產。

2. 供試土壤。供試土壤采自景泰、隴西及蘭州市安寧區長期施用辛硫磷的蔬菜地。

3.儀器設備。恒溫振蕩搖床，超凈工作臺，高壓濕熱滅菌鍋，人工氣候箱，紫外可見分光光度計。

4.培養基。一是基礎鹽培養基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。二是以辛硫磷為唯一碳源的培養基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；辛硫磷100～600 mmol；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。三是LB培養基：胰蛋白胨10.0 g；酵母粉5.0 g；NaCl 10.0 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。

（二）試驗方法

1.土壤中降解菌的馴化。菌種的馴化方式采用逐漸加量的馴化方式。取土樣10 g，將土樣加入辛硫磷質量分數為100 mmol/L的100 mL基礎鹽培養基中，在溫度28 ℃、轉速為120 r/min的條件下振蕩培養7 d，然后取10 mL培養液接入100 mL新鮮基礎鹽培養基（培養基中辛硫磷濃度每一周期逐步提高，濃度依次為200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L），振蕩培養7 d，連續馴化富集4次。

2.菌種的分離和純化。每一馴化周期，均取培養液稀釋涂布于上述培養基平板上，28 ℃恒溫培養48 h，待長出菌落后，挑取生長速度較快，菌落大而形態不一的菌落進一步分離，挑選典型的單菌落，反復純化，直到菌落表面顏色、質地等形態特征完全一致，保存。

3.菌株生長曲線的測定。取適量的純化菌株S1分別接入50 mL LB培養基和辛硫磷質量分數為50 mL（300 mmol/L）的基礎鹽培養基中，預培養到對數生長期（OD600達到0.6），將在LB中預培養的菌液按2%的接入量分別接入50 mL LB和辛硫磷質量分數為50 mL（300 mmol/L）的基礎培養基中，將含辛硫磷（300 mmol/L）的基礎培養基中預培養的菌液按2%的接入量接入辛硫磷質量分數為50 mL（300 mmol/L）的基礎培養基中，28 ℃、120 r/min搖床培養，間隔8 h取樣，用紫外分光光度計測定菌體在波長600 nm處的吸光值，繪制生長曲線。

4.降解菌在不同初始農藥濃度下的生長比較。選擇分離純化后生長良好的菌株S1接種于以辛硫磷為唯一碳源的基礎鹽培養基中，辛硫磷設置100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L 、500 mmol/L、600 mmol/L 6個不同濃度梯度，每處理3次重復。在28 ℃的恒溫箱中培養72 h后，使用紫外分光光度計測定菌體在波長600nm處的吸光值，然后進行比較。取只加農藥不接降解菌的基礎鹽培養基的吸光值校為零。

二、結果與分析

（一）降解菌的生長曲線測定結果

生長曲線測定結果如圖1所示，在LB培養基中預培養到對數生長期（OD600達到0.6）再以2%的接種量接種到50 mL LB培養基中的菌株，菌株生長遲緩期只有4 h，然后菌株迅速進入對數生長期。培養20 h菌株進入生長穩定期，到24 h就達到最大生長量，菌株的濃度不再增加。

在辛硫磷培養基中預培養再以2%的接種量接種到辛硫磷培養基的菌株，菌株生長遲緩期有8 h，然后菌株進入對數生長期，對數生長期持續時間達32 h，培養40 h進入穩定期，到48 h達最大生長量，菌株的濃度不再增加。

（二）降解菌在不同初始農藥濃度下的生長比較

由圖2可知，菌株S1在辛硫磷濃度分別為100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L的基礎鹽培養基中的OD600nm吸光值值明顯小于辛硫磷濃度300 mmol/L的基礎鹽培養基中的OD600nm吸光值。菌株S1降解辛硫磷的效率在辛硫磷濃度為300 mmol/L效率最高。低農藥濃度下菌株S1生長較弱，由于碳源不足，抑制菌株生長，從而抑制了其對辛硫磷的降解。隨著初始農藥濃度增加，菌體生長漸好，辛硫磷濃度為300 mmol/L時吸光值達到最大值，農藥降解效果最好。辛硫磷濃度持續增加時，菌株S1生長放緩，農藥濃度過高對菌株有毒害作用，抑制菌株生長，導致菌株對辛硫磷的降解降低。

（三）降解菌在不同溫度下的生長比較

由圖3可知，溫度對菌株S1的生長影響非常顯著，在25 ℃時，菌株OD600nm吸光值最大，菌株生長最好，隨著溫度的升高，其生長明顯受到抑制。由此可以推測，菌株S1的在中低溫時降解效果較好。甘肅省氣溫日差較大，年平均氣溫在0～14 ℃，而菌株S1在中低溫中生長較好，說明菌株S1能在該省大部分地區的土壤中生長。

三、結論

從試驗可以看出，溫度及初始農藥濃度對菌株的生長都有一定影響。至于初始pH值、接種量等對菌株的生長影響尚需研究。菌株S1在辛硫磷初始濃度為300 mmol/L的基礎鹽培養基中，28 ℃、120r/min搖床培養40 h，對辛硫磷的降解率初步測定達到56.45%，說明菌株S1能降解辛硫磷，菌株S1作為辛硫磷降解菌有進一步優化培養并應用于治理河南省有機磷農藥污染等方面的潛力。

圖1 菌株S1生長曲線圖

圖2 初始農藥濃度對菌株S1的生長影響

圖3 溫度對苗株S1的生長影響