一株產(chǎn)紅色素內(nèi)生真菌色素的穩(wěn)定性研究

廖月姣 蒙南村 蔣青玲

摘 要：以艾草根塊分離得到的內(nèi)生真菌WS-221為研究對(duì)象，以色素提取液吸光度為重要指標(biāo)，對(duì)該菌所產(chǎn)的色素進(jìn)行了穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：該菌所產(chǎn)色素提取液在490nm處出現(xiàn)最大吸收峰。紫外光對(duì)色素穩(wěn)定性影響較小，色素溶液中添加適量Na+、K+、Al3+具有一定的增色作用，并且食鹽濃度在0.2g/mL時(shí)增色效果明顯。綜合評(píng)價(jià)，該菌所產(chǎn)色素穩(wěn)定性良好，具有廣泛的工業(yè)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;色素提取;色素穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2019）05-0023-03

Abstract：The endophytic fungus WS-221 isolated from the wormwood root block was used as the research object，and the stability of the pigment produced by the fungus was studied by using the absorbance of the pigment extract as an important index.The results showed that the pigment extract produced by this strain showed the maximum absorption peak at490 nm.Ultraviolet light has little effect on pigment stability.Adding proper amount of Na+，K+ and Al3+ to the pigment solution has certain color enhancement effect on the pigment and the pigment coloration effect is obvious when the salt concentration is 0.2g/mL.Considering comprehensively，the pigment produced by this strain has good stability and has wide industrial value.

Key words：Endophytic fungi;Pigment extraction;Pigment stability

內(nèi)生真菌是生活或在其生活史的某一個(gè)階段生活在健康植物體內(nèi)[1-2]，與植物協(xié)同進(jìn)化，在進(jìn)化過程中逐漸演變?yōu)楣采P(guān)系的一種真菌，具有多樣性，廣泛分布于植物體內(nèi)[3]。由于植物種類、環(huán)境條件、生長階段等因素的不同，導(dǎo)致植物組織中內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類存在較大差異[4]。植物部位的不同，內(nèi)生菌的種類及多樣性也存在顯著差異[5]，內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)對(duì)宿主暫時(shí)沒有致病性[6]，同時(shí)內(nèi)生真菌之間也有著從拮抗到互利的多種共生關(guān)系[7]。

艾草又名香艾、艾蕭、艾蒿等，具有驅(qū)蚊、抗菌、護(hù)肝之功效，其葉和莖部均可產(chǎn)生奇特香味，對(duì)具有藥用價(jià)值的植物中內(nèi)生真菌的研究更具研究價(jià)值。由于天然色素安全無毒，且具有一定的營養(yǎng)價(jià)值，深受人們喜愛[8]。內(nèi)生真菌所產(chǎn)色素為天然色素，并且真菌色素與植物色素相比，其不受環(huán)境、氣候、空間的影響[9]，可以通過大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和發(fā)酵生產(chǎn)，既降低了成本，又提高了產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益[10-11]。本研究以艾草根塊內(nèi)生真菌WS-221為研究對(duì)象，對(duì)其水溶性紅色素的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究利用該菌所產(chǎn)色素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株來源 菌株，從野生艾草根塊分離純化得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 平板使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL;發(fā)酵培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL。

1.1.3 儀器設(shè)備與試劑 MaxQ436大型落地式恒溫?fù)u床，美國Thermofisher公司;UV-1800紫外可見光分光光度計(jì)，日本島津公司;HWS型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī);無水乙醇、葡萄糖、食鹽、氯化鎂、氯化鈣等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng) 用直徑為1cm的打孔器獲取生長在PDA培養(yǎng)基上具有8d菌齡的菌落，將菌餅置于裝有150mLPDB發(fā)酵液的250mL錐形瓶中，在培養(yǎng)條件為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15d。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察 用鑷子挑取培養(yǎng)基上的菌落放置于滴有蒸餾水的載玻片上進(jìn)行壓片，再通過生物顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3 色素提取 將發(fā)酵培養(yǎng)15d的菌液過濾，獲得菌絲，稱取菌絲1g分別溶于10mL蒸餾水和95%乙醇2種溶液中超聲破碎35min，在5000r/min的轉(zhuǎn)速條件下離心5min，獲得紅色素上清液。

1.2.4 吸收光譜曲線的測(cè)定 將獲得的紅色素上清液用紫外分光光度計(jì)于460～520nm范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。使用origin軟件進(jìn)行分析，以確定最佳波長并測(cè)得最佳波長條件下色素在2種不同提取溶劑中的最大吸光度。

1.2.5 紫外光對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 取紅色素上清液放置在波長為210nm的紫外燈下分別照射10、20、30、40、50、60、70min，將照射的紅色素上清液在490nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.6 pH對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 取紅色素上清液，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值為2、4、6、8、10，在黑暗的條件下放置2h，在490nm處測(cè)定色素提取液的吸光度。

1.2.7 金屬離子對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 取紅色素上清液配制成含不同金屬離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+濃度均為0.5g/mL的紅色素溶液，在黑暗的條件下放置0、2、4、6、8h，在490nm處測(cè)定紅色素溶液的吸光度。

1.2.8 不同濃度食鹽對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 取紅色素上清液將其配制成0.1g/mL、0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL的氯化鈉溶液，在黑暗的條件下放置2h，在490nm處測(cè)定紅色素溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征 該菌菌落為淡紅色，菌落表面濕潤有凸起絮狀，菌絲紅色質(zhì)密。其孢子存在于瓶梗上，并在頂端形成球團(tuán)（圖1）。

2.2 2種不同溶劑對(duì)色素提取的影響 將2種不同溶劑提取的紅色素在UV1800紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行檢查，結(jié)果如圖2所示，波長在490nm處時(shí)出現(xiàn)最大吸收峰。本研究選取成本較低的蒸餾水作為溶劑提取色素，選取490nm作為該紅色素的特征吸收波長，從而獲得紅色素提取溶液，并在D490處測(cè)得提取液的吸光度為0.388。

2.3 紫外光對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 由圖3所示，將紅色素提取液放置于210nm紫外光下進(jìn)行照射，通過控制紫外照射時(shí)間，結(jié)果顯示，在不同時(shí)間照射下該色素吸光度只在較小的范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng)，并且在40～70min范圍內(nèi)色素吸光度高于原液吸光度，說明紫外對(duì)該色素穩(wěn)定性影響較小，而且在一定條件下還具有增色作用。故該色素具有較好的抗紫外能力。

2.4 pH對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響 由圖4可知，該色素對(duì)pH較為敏感，當(dāng)pH為6時(shí)提取液吸光度與原液持平，當(dāng)pH在2～4范圍內(nèi)時(shí)出現(xiàn)較小值，且在pH為2時(shí)色素穩(wěn)定性最差，說明在酸性條件對(duì)色素的穩(wěn)定性影響較大。堿性條件對(duì)色素穩(wěn)定性有一定影響，但對(duì)堿性條件的對(duì)抗性比酸性條件強(qiáng)，說明該色素的耐酸性較差。故在實(shí)際應(yīng)用的過程中，應(yīng)盡量避免酸性物質(zhì)的使用。

2.5 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 由表1可知，在紅色素溶液中添加各種金屬離子之后，在不同的時(shí)間段部分金屬離子對(duì)色素的吸光度存在一定的影響。溶液中添加Na+、Ca2+、Al3+、Mg2+之后，在2h時(shí)達(dá)到最大值，并在4～8h范圍內(nèi)色素存在較小的波動(dòng)。在紅色素溶液中添加K+之后，在0h時(shí)有最大值，在2～8h范圍內(nèi)色素的吸光度減小，增色效果存在一定的變化。說明Na+、K+、Al3+在短時(shí)間內(nèi)對(duì)該色素具有增色作用。

2.6 不同濃度的食鹽對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 由圖5所示，該色素在NaCl濃度為0.2g/mL時(shí)出現(xiàn)最大值，當(dāng)Na+濃度在0.3～0.5g/mL時(shí)，其吸光度緩慢增加，且整體吸光度大于原液吸光度，說明Na+濃度對(duì)該色素有一定影響，但其影響有限，并且在紅色素提取液中加入食鹽對(duì)色素有一定的增色作用。故在工業(yè)生產(chǎn)過程中適量加入食鹽可以起到增色效果。

3 結(jié)論

從野生艾草中分離出來的產(chǎn)紅色素內(nèi)生真菌WS-221在PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的前期菌絲為白色，培養(yǎng)5d左右菌絲變?yōu)榈t色，背面為紅色，在搖瓶培養(yǎng)15d左右色素產(chǎn)量達(dá)到最大，在之后的培養(yǎng)過程中色素產(chǎn)量幾乎不變。實(shí)驗(yàn)表明，紫外對(duì)該真菌產(chǎn)生的紅色素的穩(wěn)定性影響較小，并且紅色素的吸光度只在較小的范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng);在pH為6～10時(shí)存在一定的穩(wěn)定性，且在pH為6時(shí)色素吸光度幾乎與原液相同;在色素溶液中添加Na+、K+、Al3+之后，在短時(shí)間內(nèi)具有一定的增色作用;不同濃度的食鹽對(duì)該色素有一定的影響，且在0.2g/mL出現(xiàn)最大值，具有較好的增色作用，故在生產(chǎn)利用該色素時(shí)可以添加一定量的Na+，以提高其色澤。如今具有保健功能的天然紅色素應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注[12]，對(duì)天然色素穩(wěn)定性的研究具有廣泛的工業(yè)價(jià)值。

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（責(zé)編：張宏民）