多花黃精組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)組培研究

謝敏 李偉 李佳欣

摘 ?要：為建立多花黃精組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以多花黃精帶芽根莖為外植體，消毒后將其置于含不同配比激素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結(jié)果表明：培養(yǎng)基MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA誘導(dǎo)不定芽生長狀況最好，平均能誘導(dǎo)5.5個不定芽，生長不定根平均數(shù)為3根;1/2MS+0.8mg/L NAA誘導(dǎo)不定根數(shù)最多，平均為20.5根。

關(guān)鍵詞：多花黃精;組織培養(yǎng);快速繁殖技術(shù)

中圖分類號 S567.239 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）05-0020-02

多花黃精（學(xué)名：Polygonatum cyrtonema Hua），是百合科黃精屬多年生草本植物[1]，其根莖中含豐富的糖類、甾體皂苷、強心苷、生物堿、黃酮及蒽醌類化合物、木脂素、維生素、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分[2]，具有潤肺滋陰、補中益氣、益腎填精、健脾、抑制腫瘤細胞等作用[3]。近年來，多花黃精已廣泛應(yīng)用于冠心病、高血壓、糖尿病、肺結(jié)核、再生障礙性貧血等病的治療，以及預(yù)防性放療、化療引起的副作用等[2]。隨著市場需求量的不斷增加和野生資源的不斷減少，人工栽培黃精已成為市場供求的主體。多花黃精在全球分布很廣，約有40多種，我國約有31種，分布于全國各地，常生在林下、灌叢、山坡陰處，海拔500～2100m。

在人工栽培中，由于種子收集難度大、發(fā)芽率低、育苗周期長等因素，導(dǎo)致多花黃精有性繁殖的方式無法滿足生產(chǎn)需要。而無性繁殖技術(shù)作為保持母體優(yōu)良性狀和快速繁育的重要手段，可以有效地解決優(yōu)良種源這一難題。近年來，許多學(xué)者都展開了一系列的研究。例如，李文金等對多花黃精進行了試管苗的生根技術(shù)的研究[4];劉紅美等對多花黃精進行了組織快繁技術(shù)的研究[5];周新華等對多花黃精的帶芽根莖進行了最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果表明平均每個根芽能誘導(dǎo)6.6個不定芽[6];周新華等在2015年對多花黃精組織增殖和生根體系的研究發(fā)現(xiàn)，在3—4月采集的外植體其長勢和腋芽萌發(fā)的表現(xiàn)最好[7-8];周建金等進行了黃精組培快繁技術(shù)研究，結(jié)果表明，理想生根、誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，生根苗經(jīng)煉苗移栽后成活率達92%以上[9]。本研究對多花黃精的帶芽根莖進行了組織培養(yǎng)，以期尋找最適培養(yǎng)基，旨在提高多花黃精繁殖系數(shù)，快速繁殖種苗，從而建立多花黃精的無性快繁體系。

1 材料與方法

1.1 材料 2016年12月至2017年6月，在貴州省六盤水市野外挖取多花黃精，切取其根狀莖的根莖芽，參考周新華等對外植體的滅菌處理方法[6]處理，將消毒后的根莖芽接種在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將從土中挖出的黃精用清水洗凈泥土。用刀切取帶芽根莖在飽和的無酶洗衣粉中泡洗30min（隔幾分鐘輕輕順時針攪動），然后流水沖洗1～1.5h，流水大小以不把外植體沖出為宜。同時打開超凈工作臺的紫外燈進行紫外殺菌，殺菌30～40min，殺菌同時打開風(fēng)機。約過20min后使用超凈工作臺進行接種，接種期間不關(guān)閉風(fēng)機。將沖洗干凈的試驗材料移至超凈工作臺內(nèi)用無菌紙吸干外植體表面上的水分，用75%酒精浸沒外植體進行消毒，浸泡時間30s，然后用無菌水清洗3次，每次3min;再用0.1%的氯化汞（升汞）溶液浸泡6～10min，用無菌水清洗6～7次（每次3min），再用無菌紙將外植體表面上的水分吸干，即完成外植體的消毒。

1.2.2 0.1%氯化汞（升汞）溶液浸泡時間 由于地下根莖表面常附著許多雜菌，給滅菌帶了來一定的難度，所以設(shè)置0.1%氯化汞（升汞）溶液浸泡外植體時間在5～15min分別做10個梯度的對比試驗。并對其接種后的污染數(shù)和組培苗的死亡數(shù)進行統(tǒng)計對比分析，找出最適合多花黃精升汞表面消毒時間。

1.2.3 多花黃精不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將消毒的黃精帶芽根狀莖接種于MS培養(yǎng)基上，選取不同濃度的6-BA、NAA等外源激素進行配比（表1），各處理的培養(yǎng)基均加入蔗糖30g/L、瓊脂7.5g/L，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，光照強度2000～3000lx，光照時間10～16h/d。從中篩選出最佳不定芽增殖生長的培養(yǎng)基，并對其不定的生長數(shù)進行統(tǒng)計。

1.2.4 多花黃精不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng) 利用不定芽增殖獲得的不定芽對其進行不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，光照強度2000～3000lx，光照時間10～16h/d。經(jīng)過2次的繼代培養(yǎng)后，記錄各培養(yǎng)基中不定根的誘導(dǎo)平均生長情況（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 0.1%氯化汞（升汞）溶液的浸泡時間 經(jīng)對比試驗，結(jié)果表明，升汞對多花黃精外植體消毒時間在6～10min較適宜。以8min最佳，5min時污染較嚴重，超過10min，組培苗出現(xiàn)死苗的現(xiàn)象。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長10d后，芽開始生長，基部明顯膨大，30d后分化出不定芽。說明本試驗所用的滅菌方法和誘導(dǎo)培養(yǎng)基是適宜的。

2.2 多花黃精不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果 由表3可知，10種培養(yǎng)基都能使黃精根狀莖發(fā)芽生長，其中以為MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA的培養(yǎng)基長勢最好，且不定芽增殖數(shù)量最多。

1、2號培養(yǎng)基黃精的生長狀況僅次于6號培養(yǎng)基，7號培養(yǎng)基生根的平均數(shù)比6號培養(yǎng)基稍多，但綜合考慮，6號培養(yǎng)基更加適合野生多花黃精的增殖培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基的不定芽生長速度遠遠低于6號培養(yǎng)基。

經(jīng)過對多花黃精不定芽增殖實驗，再利用不定芽增殖獲得的不定芽對其進行不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，適合的培養(yǎng)條件是在基本培養(yǎng)基中均加入蔗糖30g/L、瓊脂7.5g/L，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，光照強度2000～3000lx，光照時間10～16h/d。

2.3 多花黃精不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng) 由表4可知，NAA濃度從0.2mg/L到0.8mg/L時不定根增殖數(shù)不斷提高，到達0.8mg/L時增殖數(shù)達到最高，再增加NAA濃度則出現(xiàn)增殖數(shù)降低的現(xiàn)象。因此，黃精不定根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.8mg/L NAA。

3 結(jié)論

綜上所述，多花黃精外植體0.1%升汞最佳消毒時間為8min，實驗篩選出培養(yǎng)基MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA誘導(dǎo)不定芽生長狀況最佳，培養(yǎng)基1/2MS+0.8mg/L NAA誘導(dǎo)不定根數(shù)最多。

參考文獻

[1]中國科學(xué)院植物研究所.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1978.

[2]龐玉新，趙致，袁嬡，等.黃精的化學(xué)成分及藥理作用[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2003，22（6）：547-550.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[4]李文金，畢研文，陳建生，等.泰山多花黃精試管苗生根技術(shù)研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12（1）：19-21.

[5]劉紅美，方小波，夏開德，等.多花黃精組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究 [J].種子，2010，12（29）：13-17.

[6]周新華，肖智勇，王麗云，等.基于均勻設(shè)計對黃精不定芽增殖培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，31：10909-10911.

[7]周新華，朱宜春，桂尚上，等.多花黃精組培生根技術(shù)研究[J].經(jīng)濟林研究，2015，33（4）：102-105.

[8]周新華，曾滿生，肖智勇，等.多花黃精嫩莖與根莖芽離體培養(yǎng)技術(shù)[J].經(jīng)濟林研究，2014，12（4）：68-72.

[9]周建金，羅曉鋒，葉煒，等.多花黃精組培快繁技術(shù)研究[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2012（9）：59-61.

（責(zé)編：張宏民）