單獨隔離孵化對鎮海林蛙蝌蚪生長發育、社交行為和運動表現的影響

周存通,王遠飛,王海燕,韋 力,樊曉麗,丁國驊,林植華,*

1 南京師范大學生命科學學院,南京 210023 2 麗水學院生態學院,麗水 323000

卵的集中孵化和共同筑巢行為對后代具有優勢,包括反捕食作用(例如滅絕的恐龍[1]、昆蟲類[2]、蜘形綱[3]、頭足類[4]、魚類[5]、以及兩棲類[6]),促進胚胎對卵黃的吸收使后代個體的體型更大[7- 9],改變孵化環境的濕度[7],從相鄰卵的新陳代謝中獲得熱量[10- 12],使得卵在孵化過程中位置固定不變[13],確保胚胎交流能夠在同窩卵或異窩卵間進行[14- 16]。爬行類和鳥類的同窩個體間會進行胚胎交流[17- 19],卵震動,心率,氣味,巢內CO2濃度水平,這些都被認為是胚胎間潛在的溝通渠道[17]。胚胎間交流能夠調節發育速率[8,16- 18]、或者生長速率[20]促進胚胎的同步孵化。同步孵化可以降低個體被捕食風險,個體通過下沉動作躲避被捕食,從而提高個體存活幾率[20- 22]。

蝌蚪的集群行為可能是為了減少被捕食或提高覓食效率而進化的適應行為[23- 24]。蝌蚪與同種個體一起生活的經歷對個體集群行為的影響依然是不清楚的,而這種觀察結果在其他物種中也不盡相同[25- 26]。大多數關于社交隔離的影響研究只對個體的親緣和非親緣個體的識別能力進行測試評估,并沒有評估蝌蚪先前經歷過的社交環境對后續社交行為的影響[27- 28]。

野外環境中鎮海林蛙(Ranazhenhaiensis)的卵呈團狀分布,同域分布的克氏原鰲蝦(Procambarusclarkia)、食蚊魚(Gambusiaaffinis)、蜻蜓(Trameachinensis)幼蟲和巴西龜(Trachemysscriptaelegans)對蛙卵存在捕食現象[29- 30],卵團經過捕食者攝食,殘留的卵粒形成單獨隔離孵化現象。本實驗以鎮海林蛙蝌蚪為實驗動物,檢驗(1)單獨隔離孵化是否會影響蝌蚪的體型大小和發育歷期,(2)單獨隔離孵化是否會影響蝌蚪的社交行為和運動表現。

1 材料與方法

2017年1月10日,在校園內的臨時性水體中分別采得3窩鎮海林蛙卵團,發育歷期為10- 11期。將卵帶回兩棲爬行實驗室后,進行卵粒分離,解除卵粒間膠質層黏連。每窩卵隨機取出120粒,分為二組,一組作為卵群一起孵化組,另一組作為單獨隔離孵化組。卵群一起孵化組的60粒卵置于裝有曝氣24 h自來水的塑料筐(30 cm×20 cm×12 cm)中孵化,水位高度6.5 cm。單獨隔離孵化組的60粒卵單獨置于60個圓底透明塑料杯(直徑3.7 cm,高7 cm)中飼養,水位高度6.5 cm。溫度設置25℃,光照周期為12L∶12D,每天進行位置變換以減少溫差帶來的影響。

孵化過程的第5天,蝌蚪未孵出記錄各組胚胎在1 min內擺尾搏動次數,每組重復5次。

第9天,蝌蚪全部孵出但未進食,對孵出的蝌蚪進行形態特征測定。用Sony DSC-T100數碼相機拍攝后用Image J 1.44p軟件讀取蝌蚪的形態學特征,包括體長(snout-vent length)和體寬(body width)；用Sartorius天平(±0.001 g)稱體重；用Nikon XTS30體視顯微鏡鑒定發育歷期[31]；記錄實驗過程中每組蝌蚪的死亡數。蝌蚪經過形態學測量后投喂足量的牛蛙飼料(0號,寧波天邦股份有限公司)。

第11天,孵出2天后,蝌蚪已進食,同時對環境有一定的適應時間,采用靜水停飼實驗法進行水層分布觀測計數。水面以下1 cm范圍內的蝌蚪為上層,水底以上1 cm范圍內的蝌蚪為下層,其余蝌蚪為中層[32],每組重復觀測計數3次。

第12天時進行孵化條件對蝌蚪社交行為和運動表現影響的觀測實驗。在白色陶瓷盤(47 cm×39 cm×2.5 cm)上方架設一臺Sony DSC-T100數碼相機記錄蝌蚪的行為。從3窩卵群一起孵化組分別隨機選取4只蝌蚪組成12只一組的卵群一起孵化組,重復4次；從單獨孵化組的3窩蝌蚪內分別隨機選取4只蝌蚪組成12只一組的單獨隔離孵化組,重復4次。蝌蚪放入后開始錄像25 min。在數據采集分析時去除前5 min的錄像,然后每隔1 min截取1張圖像,用Image J 1.44p軟件讀取指標,包括：蝌蚪分布范圍(分布面積率,蝌蚪分布面積/容器面積),個體間距離,最近鄰距離。從第5 min開始,每隔5 min,統計1 min內蝌蚪接觸次數,將兩只蝌蚪距離小于0.5 cm時定義為一次接觸[33],運動時長和運動頻次。

以上數據采集時間均為14:00—15:00。數據用STATISTICA統計軟件包(verison 6.0)分析。在作進一步統計分析前,用Kolmogorov-Simirnov和Bartlet方法分別檢驗數據的正態性和方差同質性。用方差分析(ANOVA)、協方差分析(ANCOVA)及后續的Tukey′s多重比較分析相關實驗數據。非參數統計用χ2-檢驗。描述性統計值用平均值±標準誤表示,顯著性水平設為α=0.05。

2 結果

單獨隔離孵化組共孵出172尾,卵群一起孵化組共孵出177尾,孵化成功率組間差異不顯著(χ2=2.34,df=1,P=0.126)。

方差分析表明,孵出2天后,單獨隔離孵化組個體體長(F1, 347=877.70,P<0.001)和歷期(F1, 347=10.04,P<0.002)顯著大于卵群一起孵化組的個體。以體長協方差分析表明,特定體長的單獨隔離孵化組個體的體寬(F1, 346=49.51,P<0.001)和體重(F1, 346=8.99,P<0.003)均顯著大于卵群一起孵化組的個體(圖1)。

圖1 卵群一起孵化和單獨隔離孵化下鎮海林蛙蝌蚪發育歷期和形態特征的描述性統計值(平均值±標準誤)Fig.1 Descriptive statistics of Gosner developmental stage and morphological traits of R. zhenhaiensis larvae incubated under single-embryo and group-embryo treatment: body length, body width, body mass and gosner development stage (mean±SE)

方差分析表明,單獨隔離孵化組胚胎擺尾搏動頻次顯著小于卵群一起孵化組的個體(圖2,F1, 28=141.57,P<0.001)。在水體的上層(F1, 16=148.97,P<0.001)、中層(F1, 16=359.84,P<0.001)單獨隔離孵化組個體出現次數顯著小于卵群一起孵化組的個體次數,在水體的底層單獨隔離孵化組個體出現次數顯著大于卵群一起孵化組的個體次數(圖2,F1, 16=272.28,P<0.001)。

圖2 卵群一起孵化和單獨隔離孵化對鎮海林蛙胚胎擺尾頻次和蝌蚪活動水層分布比較(平均值±標準誤)Fig.2 Comparisons of the tail-beat frequency of embryos and the occurrence frequency of R. zhenhaiensis tadpoles between single-embryo and group-embryo treatment (mean±SE)

方差分析表明,單獨隔離孵化組個體的分布面積率(F1, 166=107.08,P<0.001)、最近鄰距離(F1, 2014=41.81,P<0.001)、個體間距離(F1, 15831=114.13,P<0.001)均顯著大于卵群一起孵化組的個體,單獨隔離孵化組個體的接觸頻次(F1, 158=75.17,P<0.001)、運動時長(F1, 1336=119.46,P<0.001)、運動頻次(F1, 38=19.79,P<0.001)均顯著小于卵群一起孵化組的個體(圖3)。

圖3 卵群一起孵化和單獨隔離孵化對蝌蚪的活動行為和運動表現的影響: 分布面積率、最近鄰距離、個體間距離、接觸頻次、運動時長和運動頻次(平均值±標準誤)Fig.3 Effects of hatchling condition on the activity behavior and locomotor performance of R. zhenhaiensis tadpoles: the proportions of area occupied by tadpoles, nearest neighbor distance, distance among individuals, contact frequency, activity duration and activity frequency (mean±SE)

3 討論

本實驗結果表明單獨隔離孵化處理會使鎮海林蛙蝌蚪體型變大(圖1),這與歐洲林蛙Ranatemporaria蝌蚪結果一致[26],而與爬行類中的三線石龍子(Bassianaduperreyi)[7],東澳長頸龜(Chelodinalongicollis)[8]和蝰水蛇(Natrixmaura)[9]結果相反,導致這樣的原因可能跟物種對卵黃的吸收[9],個體的運動水平[6],種群密度及其種內競爭有關[34]。例如,更快發育和過早孵化將改變蝰水蛇胚胎對卵黃的吸收,使得幼蛇體內具有更高的脂肪含量[16]。無尾兩棲類個體肌肉組織占比較大,運動過程耗能較高[6],卵群一起孵化組個體胚胎擺尾搏動更為頻繁導致個體在未進食情況下更多消耗脂肪[5- 36],使得個體體型相較于單獨隔離孵化組個體較小。做出運動決策的可能原因是個體對能量消耗-獲利的權衡,卵群一起孵化組個體發育時間較長,對卵黃的吸收更為完全,儲存的能量可以用于活動代謝,而加速孵化導致個體儲能不足,使個體更傾向于采取保守的保存能量策略[37]。此外,單獨隔離孵化處理組的發育歷期要比卵群一起孵化組大(圖1),而且發育歷期的變異系數也比卵群一起孵化組大(C.Vsingle=0.0270, C.Vgroup=0.0259),說明單獨隔離孵化使得鎮海林蛙胚胎發育加速,卵群一起孵化促進胚胎發育同步,這與Nicieza[26]和Aubret[9]的研究結果一致。當卵周圍沒有卵或卵較少時(單獨隔離孵化),表明當前環境具有較高的被捕食風險或者說資源較少,這會促進個體加速發育,快速離開當前環境[9]。而較大窩卵數(卵群一起孵化)表明當前環境相對安全或者說資源充裕,個體沒有必要加速發育從當前環境逃離,而且逃離這里也是有風險的[38],所以蝌蚪選擇同步發育共同分擔風險。以往的研究也表明了發育同步可以提高后代個體的存活幾率[20- 22]。這種情況也存在于其他動物,例如,海龜產卵的淺層地下巢穴存在自上而下的溫度梯度(相差6℃[39]),底部卵(孵化溫度較低)會通過加速發育或過早孵化促進個體同步孵化,雖然過早孵化會降低孵化個體的運動表現[16- 18],但從長遠角度看集群同步孵化帶來的好處可以彌補這一缺陷[21]。

在本實驗中單獨隔離孵化處理使得蝌蚪集群行為減弱,個體間的接觸頻次顯著降低,蝌蚪的分布面積比率、最近鄰距離和個體間距離顯著大于卵群一起孵化組(圖3)。動物常會通過空間集群行為作為反捕食策略[40-41],例如通過個體間的協調運動威懾捕食者,或提高個體的警覺效率,或減弱由于稀釋效應而導致的個體被捕食者檢測到的可能性,從而降低捕食風險[42]；蝌蚪的集群行為可能是試驗動物對特定食物的偏好而不是對同種個體信息的偏好造成的(鋤足蟾Scaphiopusmultiplicatus[43])；在自然環境中觀察到的蝌蚪的聚集行為也有可能是由于產卵數量大或環境刺激(如溫度,底物的偏好或食物團塊)的結果而不是社交行為調節的結果(歐洲林蛙R.temporaria[44])。本行為觀察實驗過程中并未給予蝌蚪食物,并在恒定溫度條件完成,所以有理由認為先前的孵化條件會影響個體后續的集群行為模式。

卵群一起孵化時個體間可以通過卵震動、心率變化和化學信號彼此進行交流,在胚胎間建立“社交樞紐,Social bonds”[9,14- 17]。單獨隔離孵化處理阻斷了胚胎間的“社交樞紐”,不僅改變了個體的集群行為模式,還改變了個體的運動表現(圖3)。單獨隔離孵化組個體對周圍環境的警覺性較高,更傾向于待在水底,活動水平較低(圖2)。這與黃條背蟾蜍(Bufocalamita)蝌蚪在有捕食者存在的情況下會減弱活動水平并且改變空間分布的結果一致[45]。而卵群一起孵化組個體對外界環境探索的范圍更加寬泛,活動水平也高于單獨隔離孵化組。這種行為在卡斯卡迪蛙(Ranacascadae)[46]和歐洲林蛙(R.temporaria)[26]蝌蚪中也有發現。在絕大多數的無尾兩棲類中,當個體感知到當前環境具有較高的捕食風險時通常會選擇減少運動[26,47-48]。這種行為策略可以降低捕食者的檢測速率,因為蝌蚪的天敵通常是視覺導向(如蜻蜓Diastatopsobscura幼蟲)或通過水體振動(如狼蛛Schizocosaocreata)來感知獵物,尤其是生活在臨時性水體內的個體[49]。

總之,單獨隔離孵化使得孵化個體發育較快,體型較大,社會性和活動水平較低,依靠擴大活動范圍和個體間距離逃離高被捕食風險區。而卵群一起孵化使得個體發育同步,社會性更高,通過數量優勢提高警惕或進行集體防御[42],從而稀釋個體被捕食風險并增加個體存活機率[20- 22]。