不同品種茶樹新梢響應(yīng)“倒春寒”的轉(zhuǎn)錄組分析

王君雅，陳瑋，劉丁丁，陳亮，姚明哲，馬春雷*

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不同品種茶樹新梢響應(yīng)“倒春寒”的轉(zhuǎn)錄組分析

王君雅1,2，陳瑋1,2，劉丁丁1,2，陳亮1，姚明哲1，馬春雷1,2*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江杭州 310008； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

為探究“倒春寒”凍害對不同品種茶樹新梢轉(zhuǎn)錄水平的影響，本研究以茶園“倒春寒”發(fā)生時受凍害和未受凍害的龍井43和中茶126新梢為研究材料，對兩組樣品進行轉(zhuǎn)錄組分析，分別鑒定到1?012個和1?079個差異基因，以及284個共同差異基因。從中選取18個差異基因進行實時熒光定量PCR驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因進行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)兩個品種的差異基因主要集中在光合作用、碳代謝和細(xì)胞色素P450等代謝進程，說明“倒春寒”對新梢生長發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)代謝造成了嚴(yán)重?fù)p傷，抑制了相關(guān)基因的正常表達(dá)；隨后對284個共同差異基因進行表達(dá)聚類分析，結(jié)果表明，其中99個差異基因在兩個茶樹品種中的表達(dá)模式完全相反，涉及的生物過程包括MAPK信號通路、谷胱甘肽和苯丙烷代謝等，推測這些差異基因與龍井43和中茶126在受到低溫脅迫后產(chǎn)生的不同信號傳導(dǎo)模式有關(guān)。

茶樹；倒春寒；轉(zhuǎn)錄組；差異基因

茶樹[(L.) O. Kuntze]抗寒性研究包括茶樹抵御低溫的越冬抗性和春季抗“倒春寒”能力這兩個方面。早期大多數(shù)研究主要圍繞前者開展，多以茶樹的成熟葉片為研究對象，通過對茶樹葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜透性、細(xì)胞液濃度，以及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等保護性酶活性進行檢測，從而實現(xiàn)抗寒茶樹資源的鑒定篩選。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)在茶學(xué)研究中的不斷應(yīng)用，很多低溫響應(yīng)相關(guān)的基因也得到克隆和鑒定，如Wang等[1]采用抑制性消減雜交技術(shù)對低溫處理前后的茶樹葉片進行檢測分析，篩選到10個在茶樹中受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，包括β-淀粉酶、查爾酮合成酶和黃酮醇合成酶基因等。Wang等[2]分離克隆了2個茶樹低溫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和，并且發(fā)現(xiàn)4℃處理茶樹葉片后，的表達(dá)快速升高。隨后，茶樹精胺合酶[3]、CsbZIP轉(zhuǎn)錄因子[4]、H1組蛋白家族成員[5-6]、NAC轉(zhuǎn)錄因子家族[7]、水通道蛋白[8]等均被報道在茶樹低溫響應(yīng)過程中起重要調(diào)控作用。Wang等[9]通過對冷馴化不同階段的茶樹成熟葉片進行全轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)糖代謝和Ca2+信號途徑在茶樹冷馴化過程中起關(guān)鍵作用。這2個途徑相關(guān)基因在茶樹低溫響應(yīng)中的作用在后續(xù)的研究中被進一步證實[10-12]。

近些年，由于“倒春寒”對江南茶區(qū)和江北茶區(qū)的綠茶生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[13]，茶樹響應(yīng)“倒春寒”的機理研究越來越受關(guān)注。如Hao等[14-15]利用人工氣候室模擬茶樹冷馴化、脫馴化和“倒春寒”冷脅迫的發(fā)生條件，對龍井43不同發(fā)育時期的新梢進行比較轉(zhuǎn)錄組分析和代謝組分析，提出4℃是茶園“倒春寒”發(fā)生的溫度閾值，并推測MAPK介導(dǎo)的乙烯和鈣離子信號是茶樹新梢響應(yīng)“倒春寒”的兩個主要早期途徑。而在自然條件下，“倒春寒”對茶樹的影響是一個復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，涉及到茶園的生態(tài)環(huán)境、小氣候條件、栽培模式，以及不同茶樹品種的抗寒性、芽葉形態(tài)、物候期等。因此，本研究以“倒春寒”發(fā)生時兩個茶樹品種受凍害和未受凍害的新梢為研究材料，比較分析二者的轉(zhuǎn)錄水平差異，以期為茶樹響應(yīng)“倒春寒”機制研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2018年春季“倒春寒”發(fā)生時，栽植于國家種質(zhì)杭州茶樹圃內(nèi)的十年生龍井43和中茶126新梢。物候期觀測結(jié)果顯示，龍井43的一芽一葉期為3月19日，一芽二葉期為3月26日，中茶126的一芽一葉期為3月15日，一芽二葉期為3月23日。2018年4月份杭州遭遇低溫寒潮，氣溫從四月初開始持續(xù)降低（圖1-A），4月7日晚間氣溫降至6℃，8日早上茶園發(fā)生明顯的霜凍現(xiàn)象，霜凍后兩個品種未受凍害的正常新梢仍然保持嫩綠色，而受凍害的新梢呈現(xiàn)黃褐色。課題組于同一時間分別選取兩個品種未受凍害（CK）和受凍害（CS）的一芽二葉新梢（圖1-B），用液氮固定后保存于–80℃超低溫冰箱，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序和RT-qPCR驗證。

注：A：藍(lán)色箭頭代表日氣溫降至最低的日期，黑色箭頭表示取樣時間；B：a：中茶126受凍害新梢；b：中茶126未受凍害新梢；c：龍井43受凍蓬面；d：龍井43受凍害和未受凍害新梢比較

1.2 樣本總RNA提取和cDNA文庫構(gòu)建

使用Trizol試劑盒提取各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA的濃度和質(zhì)量，利用mRNA特有的polyA結(jié)構(gòu)純化總RNA中的mRNA，再通過離子打斷的方式，將mRNA打斷成200~300?bp片段，以此為模板，通過隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶相繼合成cDNA第一鏈和第二鏈，構(gòu)建鏈特異性文庫。采用PCR擴增進行文庫片段富集，通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫片段進行質(zhì)檢，為各樣本的cDNA文庫加上不同index序列，按比例混合，稀釋到2?nmol·L-1，通過堿變性形成單鏈文庫。

1.3 Illumina測序、數(shù)據(jù)質(zhì)檢和參考基因組比對

通過Illumina HiSeq測序平臺，對文庫片段進行雙末端（Paired-end，PE）測序，得到原始下機數(shù)據(jù)fastq文件。使用FastQC軟件的默認(rèn)參數(shù)對fastq文件進行測序質(zhì)量統(tǒng)計，使用Cutadapt軟件進行reads的過濾和去除低質(zhì)量序列（overlap≤10?bp，20%的堿基錯誤率），最終得到高質(zhì)量的clean reads。再通過Bowtie2和Tophat2將clean reads比對至舒茶早茶樹參考基因組[16]，得到SAM/BAM比對結(jié)果文件。

1.4 基因表達(dá)量分析

利用SAM/BAM文件和參考基因組的結(jié)構(gòu)注釋GTF文件，通過HTseq軟件的union方案統(tǒng)計比對至每個轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)目，用FPKM對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進行標(biāo)準(zhǔn)化。采用DEGseq軟件進行差異基因篩選，差異基因的篩選條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1（FoldChange=CS/CK），顯著性-value<0.05。

1.5 差異基因富集分析和表達(dá)分析

利用GO和KEGG公共數(shù)據(jù)庫，以整個基因組為背景，利用超幾何分布計算差異基因顯著富集的GO term和KEGG pathway，以確定差異基因顯著富集的GO功能條目以及主要參與的代謝途徑和信號通路。利用Pheatmap軟件繪制各樣本中基因表達(dá)量的熱圖。

1.6 實時熒光定量PCR驗證

表1 RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控和參考基因組比對結(jié)果

本次試驗共構(gòu)建了4個cDNA文庫，根據(jù)每個文庫下機數(shù)據(jù)的堿基錯誤率、高質(zhì)量reads數(shù)目和數(shù)據(jù)量統(tǒng)計結(jié)果（表2），結(jié)合單堿基質(zhì)量分布圖、堿基含量分布圖，以及reads平均質(zhì)量分布，表明本次RNA-seq測序錯誤率小、單堿基質(zhì)量高、無AT/CG分離。Clean reads與舒茶早茶樹參考基因組的比對結(jié)果顯示，各樣品的clean reads與參考基因組的比對率達(dá)到79%，其中在基因組上比對位置單一的clean reads中，比對至基因外顯子區(qū)域的reads數(shù)占比高于85%，結(jié)合測序reads在基因上覆蓋度的分布情況，說明本次RNA-seq的reads整體測序質(zhì)量好、與參考基因組的比對率高，符合后續(xù)分析要求。

2.2 差異基因分析

兩個組合差異基因的基本分布圖顯示（圖2），龍井43的受凍新梢與正常新梢相比，一共檢測到1?012個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的有438個基因，下調(diào)的有532個基因；中茶126的受凍新梢與正常新梢相比，共檢測到1?079個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的有452個基因，下調(diào)的有627個基因。兩個組合的差異基因用韋恩圖呈現(xiàn)，結(jié)果顯示有284個基因在兩個品種中都呈現(xiàn)差異表達(dá)，可能與其共有的“倒春寒”響應(yīng)模式有關(guān)。

2.3 差異基因的GO富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示（圖3），龍井43受凍新梢與正常新梢的差異表達(dá)基因一共被顯著富集到34個GO功能類別。在最顯著的GO功能類別中，屬于分子功能類別的有葉綠素/色素結(jié)合、金屬離子/陽離子結(jié)合等；屬于細(xì)胞組分類別的有光合系統(tǒng)、類囊體、膜蛋白復(fù)合體等；屬于生物過程類別的有光合作用、光吸收、光反應(yīng)等。中茶126受凍新梢和正常新梢的差異基因GO功能富集結(jié)果與龍井43相似，除了具有二者相同的富集功能外還包含質(zhì)子ATP酶活性、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運、嘌呤核苷三磷酸生物合成等。表明倒春寒凍害使兩個品種的光合作用和碳代謝等基礎(chǔ)代謝發(fā)生了巨大的變化，中茶126的細(xì)胞膜受倒春寒凍害的影響可能較龍井43顯著。葉綠體等細(xì)胞器對低溫極為敏感，低溫霜凍會導(dǎo)致葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的瓦解，抑制新梢的光合作用，影響葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，其中包括細(xì)胞核中的葉綠體蛋白編碼基因和葉綠體基因。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

注：LJ43_CK：未受凍害的龍井43新梢；LJ43_CS：受凍害的龍井43新梢；ZC126_CK：未受凍害的中茶126新梢；ZC126_CS：受凍害的中茶126新梢。下同

Note: LJ43_CK: unfrozen shoots of LJ43. LJ43_CS: frozen shoots of LJ43. ZC126_CK: unfrozen shoots of ZC126. ZC126_CS: frozen shoots of ZC126. The same below

圖2 兩個品種的差異基因火山圖（A，C）和韋恩圖（B）

圖3 兩個品種差異基因顯著富集的GO分類

2.4 差異基因的KEGG富集分析

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示（圖4），在兩個品種中均顯著富集的代謝通路有光合作用、細(xì)胞色素P450以及碳代謝等。其中龍井43和中茶126分別有38個和18個差異基因富集在光合作用代謝通路中，包括編碼光吸收復(fù)合體蛋白、鐵氧還蛋白、光系統(tǒng)I亞基，光系統(tǒng)II亞基的相關(guān)基因，這些基因在受凍新梢中的表達(dá)水平均顯著低于正常新梢；同樣，在碳代謝通路中，我們發(fā)現(xiàn)有超過三分之二的差異基因（LJ43：20/26；ZC126：20/28）在受凍新梢中的表達(dá)水平顯著低于正常新梢。說明霜凍破壞新梢基礎(chǔ)代謝，抑制了光合作用和碳代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進而造成組織失綠壞死。細(xì)胞色素P450代謝通路中顯著富集的差異基因的編碼蛋白主要是谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase，GST），GST催化谷胱甘肽的巰基與親電子類物質(zhì)結(jié)合，保護核酸和蛋白質(zhì)免受自由基損傷，多數(shù)富集的基因在龍井43（9/16）受凍新梢中的表達(dá)水平顯著高于正常新梢，而在中茶126（8/10）的凍梢中的表達(dá)水平顯著低于正常新梢。同樣在非酶促抗氧化過程起重要作用的抗壞血酸鹽、類黃酮代謝途徑相關(guān)基因在兩個品種中的富集程度不同，表明倒春寒凍害發(fā)生時，兩個品種受凍新梢的抗氧化機制存在一定差異。

除了共同富集的代謝通路外，龍井43受凍新梢和正常新梢差異基因顯著富集的代謝通路還包括萜類骨架的生物合成和肌醇磷酸代謝等，中茶126受凍新梢和正常新梢差異基因則在色氨酸代謝、硫代謝以及乙醛酸和二羧酸代謝等通路中富集。其中萜類骨架是脫落酸和赤霉素的合成前體，可能參與激素的合成和信號響應(yīng)；肌醇磷酸代謝中三磷酸肌醇是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，是Ca2+信號通路的上游信號因子，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)；而色氨酸代謝、硫代謝以及乙醛酸和二羧酸代謝等通路中也包含了大量起到信號傳導(dǎo)的次生代謝物。推測這些差異代謝通路與兩個品種受到低溫脅迫后產(chǎn)生的不同信號傳導(dǎo)模式有關(guān)。

注：A：龍井43；B：中茶126 Note: A: LJ43. B: ZC126

2.5 兩個品種共有差異基因的表達(dá)分析

根據(jù)差異基因在4個樣本中的表達(dá)趨勢，將284個共同差異基因分成3組（圖5）。第I組的49個差異基因（圖5-I）在兩個品種受凍新梢中的表達(dá)量都顯著高于正常新梢。基因注釋結(jié)果顯示，該組中差異基因的編碼蛋白包括在細(xì)胞膜信號傳導(dǎo)過程起關(guān)鍵作用的膜受體蛋白激酶，與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的低溫誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白、含CCCH結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白、CBF2（C-repeat Binding Factor 2）、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（Ethylene Responsive Factor，ERF）等，類異戊二烯合成途徑的關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和異戊二烯合酶，以及參與蛋白質(zhì)翻譯、木質(zhì)素和纖維素生物合成等生物過程相關(guān)蛋白。

第III組包含146個差異基因，它們在兩個品種受凍新梢中的表達(dá)量顯著低于正常新梢（圖5-III）。基因注釋結(jié)果表明，該組差異基因的編碼蛋白主要包括葉綠體和光合作用相關(guān)蛋白，與細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族、水通道蛋白、肌醇轉(zhuǎn)運蛋白等，參與信號傳導(dǎo)的含RING和轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，與激素信號傳導(dǎo)相關(guān)的脫落酸、生長素受體蛋白，病程相關(guān)蛋白及其他生物過程相關(guān)蛋白。由此推測，膜受體蛋白激酶將外界低溫信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，在肌醇磷酸信號途徑的介導(dǎo)下，誘導(dǎo)低溫響應(yīng)相關(guān)的CBF、ERF等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。同時凍害損傷植物細(xì)胞膜和葉綠體等低溫敏感細(xì)胞器，抑制細(xì)胞膜的物質(zhì)運輸，推測在受凍害的新梢組織中，基于細(xì)胞膜完整性的低溫響應(yīng)信號通路被切斷，莖尖生長受抑制，導(dǎo)致其無法抵抗倒春寒的凍害。

注：第I組基因（白框內(nèi)）在兩個品種受凍新梢中的表達(dá)水平均顯著高于正常新梢；第II組（無框）基因在兩個品種中的表達(dá)模式相反；第III組基因（黃框內(nèi)）在兩個品種受凍新梢中的表達(dá)水平均顯著低于正常新梢

與I組和III組中基因的表達(dá)模式不同，第II組中的99個差異基因（圖5-II）在兩個茶樹品種受凍新梢和正常新梢中的表達(dá)模式相反，其中在龍井43受凍新梢中高表達(dá)，而在中茶126受凍新梢中低表達(dá)的差異基因有44個，涉及的功能和代謝途徑主要有糖基轉(zhuǎn)移酶、肽鏈水解酶、甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙烷代謝、質(zhì)體磷酸鹽離子穩(wěn)態(tài)以及MAPK信號傳導(dǎo)途徑和GTP酶激活蛋白等。在龍井43受凍新梢中低表達(dá)，而在中茶126受凍新梢中高表達(dá)的差異基因有55個，涉及的功能和代謝途徑主要有葡萄糖轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、質(zhì)膜粘多糖的水解代謝和肌醇磷酸代謝、細(xì)胞骨架的驅(qū)動蛋白組分等。

2.6 實時熒光定量PCR分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定到的差異基因中選取了18個可能參與低溫響應(yīng)過程的基因進行實時熒光定量PCR分析。其中、、、、、基因分別編碼定位于葉綠體的光吸收蛋白復(fù)合體、光系統(tǒng)II亞基、光保護蛋白、原葉綠素酸酯還原酶、ATP合酶γ亞基、葉綠素a/b結(jié)合蛋白；、、、基因編碼ICE-CBF低溫響應(yīng)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；、基因編碼細(xì)胞膜上重要受體蛋白激酶；基因編碼幾丁質(zhì)誘導(dǎo)受體激酶1；基因編碼MFC轉(zhuǎn)運蛋白超家族的肌醇轉(zhuǎn)運蛋白；基因編碼類異戊二烯合成途徑的關(guān)鍵酶；基因編碼生長素受體蛋白；基因編碼花色素3-O-葡萄糖苷2--木糖基轉(zhuǎn)移酶；基因編碼熱激蛋白。采用相對定量方法，對這些基因在龍井43和中茶126受凍新梢和正常新梢中的表達(dá)差異進行檢測。將RT-qPCR得到的基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，除了有兩個基因表達(dá)趨勢相反外，其他基因的表達(dá)趨勢基本是一致的（圖6），說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。

3 討論

低溫凍害對植物幼嫩組織的直接危害是損傷細(xì)胞生物膜、細(xì)胞器，抑制新梢基礎(chǔ)代謝和生長發(fā)育活動，嚴(yán)重凍害則直接導(dǎo)致幼嫩組織徹底壞死。植物葉綠體對低溫極為敏感[17-18]，短暫低溫處理就會破壞光系統(tǒng)中光能吸收、轉(zhuǎn)運和消耗的動態(tài)平衡[19]，過剩的光能會對光反應(yīng)中心造成不可逆失活，并積累氧自由基，進一步損傷葉綠體內(nèi)部膜組織和其他細(xì)胞器，抑制葉綠體色素代謝、光合作用等生物過程。因此，植物受凍害損傷時往往伴隨著芽葉的枯焦褐化。本試驗在轉(zhuǎn)錄水平上鑒定到大量與葉綠體和光合作用相關(guān)的差異基因，它們在龍井43和中茶126的受凍新梢中均呈現(xiàn)下調(diào)的表達(dá)趨勢，其中包括編碼光反應(yīng)中心亞基的、等[20]，表明凍害造成的組織損傷抑制了葉綠體中相關(guān)基因的表達(dá)。此外，有研究表明低溫可以誘導(dǎo)葉綠體依賴型氨基酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)[21]，本研究也發(fā)現(xiàn)葉綠體中支鏈氨基酸（Ala，Leu，Ile）和其他游離氨基酸相關(guān)基因在受凍新梢中的表達(dá)量顯著高于正常新梢（4~256倍）。而且核編碼葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄受光合作用電子傳遞和質(zhì)體信號傳導(dǎo)的影響[22-23]，因此，我們推測凍害造成的葉綠體結(jié)構(gòu)損傷一方面改變了葉綠體的氧化還原狀態(tài)、離子轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)等，通過葉綠體和細(xì)胞核的相互作用，影響核編碼葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面不完整的葉綠體結(jié)構(gòu)直接抑制了葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄。另外，低溫脅迫下產(chǎn)生的自由基會促使機體啟動較強的氧自由基清除反應(yīng)，以增強植物的抗凍能力[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，龍井43和中茶126新梢可能啟動不同程度的抗氧化反應(yīng)，具體表現(xiàn)為谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸代謝途徑、類黃酮代謝途徑等相關(guān)蛋白編碼基因在兩個品種受凍新梢和正常新梢中的表達(dá)差異。

低溫信號也會啟動植物體內(nèi)的一系列應(yīng)答反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)錄水平上研究得最為深入的是ICE-CBF（Inducer of CBF Expression-C-Repeat Binding Factor）低溫響應(yīng)信號通路，該信號通路在植物低溫響應(yīng)和冷馴化中起關(guān)鍵作用，是植物中普遍存在的保守機制[25-26]。本研究鑒定到基因在龍井43和中茶126受凍新梢中的表達(dá)均高于正常新梢（2.5~11.3倍）。除此之外，熱激蛋白、與病程相關(guān)蛋白等在許多研究中被證實在低溫誘導(dǎo)下大量合成，并直接或間接發(fā)揮增強植物抗凍性的作用[27-29]，本研究鑒定到的內(nèi)源幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)誘導(dǎo)受體激酶、植物甜蛋白、抗病蛋白等病程相關(guān)蛋白以及HSP90等熱激蛋白編碼基因在兩個品種中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。此外，植物激素信號也常與細(xì)胞內(nèi)其他信號途徑相耦聯(lián)，參與植物的低溫響應(yīng)過程，如脫落酸、赤霉素和水楊酸等激素信號都對CBF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)起重要調(diào)控作用[30-32]。脫落酸和赤霉素分別屬于倍半萜類和二萜類化合物，本研究也鑒定到多個萜類骨架相關(guān)代謝通路的差異基因，如萜類骨架的關(guān)鍵酶編碼基因和基因分別在兩個品種受凍新梢中呈現(xiàn)上調(diào)（2.8倍）和下調(diào)（80%）的表達(dá)趨勢，生長素受體蛋白基因則被檢測到在兩個品種受凍新梢中的表達(dá)低于正常新梢。這些結(jié)果表明植物通過一系列信號傳導(dǎo)將外界低溫信號傳入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)相關(guān)基因啟動防御機制，但不同品種的信號傳導(dǎo)過程卻并不一致，其相關(guān)機制還有待進一步的研究。

注：黑色條和白色條分別表示基因在龍井43和中茶126受凍新梢（CS）和正常新梢（CK）的相對表達(dá)水平，紅色趨勢線條表示轉(zhuǎn)錄組測序得到的該基因在兩個品種受凍新梢和正常新梢的表達(dá)趨勢。“*”代表基因在CS和CK之間的表達(dá)差異顯著性，*：<0.05，**：<0.01

Note: The black and white bars represent the relative expression of the genes in the frozen shoots (CS) of LJ43 and ZC126, respectively. The red line indicates the expression pattern of the genes in CS and CK obtained from RNA-seq. ‘*’ refers to the significance of difference between CS and CK in each group. *:<0.05, **:<0.01

基因名稱及其編碼蛋白如下：The genes name and its encoded proteins are as follows.: light-harvesting complex II.: photosystem II core complex proteins.: protochlorophyllide reductase.: AP2 domain CBF protein.: ethylene-responsive transcription factor.: G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase.: inositol transporter 1.: hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH).: ATP synthase gamma chain.: photosystem II 22 kDa protein.: chlorophyll a/b binding protein 4.: anthocyanidin 3--glucoside 2--glucosyltransferase.: Rho GTPase activating protein 1.: heat shock protein 90kDa.: AP2 domain-containing transcription factor.:indole-3-acetic acid inducible 14.:chitin elicitor receptor kinase 1.: zinc finger CCCH domain-containing protein

圖6 實時熒光定量PCR驗證

Fig.6 The validation of Real-time quantitative PCR

春季茶樹新萌發(fā)的新梢細(xì)胞壁薄、含水量高、滲透調(diào)節(jié)能力弱；由于生長代謝旺盛，其具有較強的光合作用和呼吸作用，此時外界短時的霜凍天氣極易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)損傷、代謝紊亂，造成新梢的褐化和死亡。本研究以兩個茶樹品種的倒春寒受凍新梢為研究材料，以相同條件下正常新梢為對照，分別鑒定到1?012個和1?079個差異基因，以及284個共同差異基因。通過GO和KEGG富集分析、基因功能注釋，鑒定到大量與新梢基礎(chǔ)代謝、低溫響應(yīng)相關(guān)的蛋白和代謝通路。發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種對“倒春寒”的響應(yīng)機制存在差異，相關(guān)研究結(jié)果可為茶樹響應(yīng)“倒春寒”機制的闡明提供一定的參考。

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The Transcriptome Analysis of Different Tea Cultivars in Response to the Spring Cold Spells

WANG Junya1,2, CHEN Wei1,2, LIU Dingding1,2, CHEN Liang1, YAO Mingzhe1, MA Chunlei1,2*

1. Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100081, China

In order to explore the effect of freezing damage caused by spring cold spells on the transcription profiling of young shoots of different tea cultivars, transcriptome analysis of the frozen and unfrozen shoots was performed on tea cultivar‘Longjing 43’ and ‘Zhongcha 126’ during the cold spells. A total of 1?012 and 1?079 differentially expressed genes (DEGs) were identified in two cultivars with 284 DEGs overlapped. Then, eighteen DEGs were selected for Real-time quantitative PCR verification. The results were consistent with the transcriptome sequencing results, indicating that the transcriptome data was reliable. Utilizing the GO and KEGG pathway databases, the enriched pathways of the DEGs were identified, which included photosynthesis, carbon metabolism and cytochrome P450. This indicates that the cold spells cause serious damage to the basal metabolism related to the normal growth and development of young tea shoots and inhibit the expression of related genes. Subsequently, the expression cluster analysis of 284 overlapped DEGs showed that 99 DEGs exhibited the opposite expression patterns in two cultivars. The involved biological processes included MAPK signaling pathway, glutathione and phenylpropanoid metabolism. It was speculated that these DEGs were related to different signal transduction patterns in ‘Longjing 43’ and ‘Zhongcha 126’ in response to low temperature stress.

tea plant, cold spells, transcriptome, differentially expressed genes

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)02-181-12

2019-01-07

2019-02-12

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、國家自然科學(xué)基金（31100504、31170624）、浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2016C32024）、浙江省農(nóng)業(yè)（茶樹）新品種選育重大科技專項子課題（2016C02053-5）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所基本科研業(yè)務(wù)費（1610212017008、1610212016002）

王君雅，女，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種與遺傳改良研究，wjy_8995@163.com。

malei220@tricaas.com