胃癌組織中趨化因子及其受體相關(guān)變化及作用分析

王鵬飛，金勁激，胡暢遠(yuǎn)，陳文靜，朱冠保，程駿

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

胃惡性腫瘤在全球遍發(fā)，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。趨化因子可調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展[1]。每一種趨化因子的功能作用均有不同，CXC族趨化因子配基17（CXC chemokine ligand 17，CXCL17）是一個與黏膜相關(guān)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定趨化因子[2-3]，在某些胃癌中也發(fā)現(xiàn)CXCL17的表達(dá)[4-5]，但在其發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制少見報道。本課題組檢測胃癌微環(huán)境中趨化因子的差異表達(dá)情況，并通過生物信息學(xué)分析其相關(guān)作用，從中挑選出CXCL17在mRNA水平及蛋白水平分別進(jìn)行驗證，并結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)分析其臨床相關(guān)性，為胃癌的綜合防治策略提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料和標(biāo)本 趨化因子及其受體基因表達(dá)譜PCR芯片由江蘇楚天生物科技有限公司定制。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自上海Toyobo公司，小鼠抗人CXCL17蛋白抗體購自美國R＆D公司，HRP標(biāo)記羊抗小鼠 II抗、羊血清和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司，引物由華大基因科技股份有限公司合成。30例胃癌及相應(yīng)癌旁正常組織均取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的胃癌術(shù)后標(biāo)本，均經(jīng)病理組織檢查證實。組織新鮮標(biāo)本在手術(shù)切除后30 min內(nèi)在液氮中保存，以備RNA提取，石蠟標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和PCR基因芯片檢測：提自液氮保存的胃癌及其相應(yīng)癌旁正常組織（距腫瘤病灶大于5 cm）3對，分別剪碎并混合，參照TRIzol試劑說明書抽提總RNA并進(jìn)行純化、質(zhì)檢，應(yīng)用趨化因子及其受體PCR芯片進(jìn)行qRT-PCR檢測胃癌組織及癌旁正常組織中基因表達(dá)差異情況。cDNA按照Rever-Tra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以15 μL反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR，PCR芯片中每孔已固定有特異性引物，反應(yīng)體系包括1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2×SYBR Green I Master Mix。步驟為：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次（BIO-RAD，CFX96），采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中各基因相對表達(dá)量。

1.2.2 癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)資料收集與分析：從TCGA數(shù)據(jù)庫中（https∶//cancergenome.nih.gov/）下載并預(yù)處理胃癌數(shù)據(jù)集（STAD）的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，共有32個正常樣本及376個腫瘤樣本。利用R語言對數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析，從中找出CXCL17基因的表達(dá)情況，明確其在腫瘤與正常組織中的表達(dá)差異情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色：胃癌及癌旁配對正常組織石蠟切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶。經(jīng)過微波修復(fù)，冷卻至室溫后，羊血清封閉1 h。甩去血清后滴加CXCL17特異性抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下復(fù)溫30 min后滴加羊抗鼠二抗，37 ℃孵育30 min。PBS清洗后進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、中性樹膠封片。以已知免疫組織化學(xué)染色陽性的切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。平均吸光度值由Image-Pro Plus 6.0軟件檢測所得。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用±s表示，對免疫組織化學(xué)結(jié)果與各臨床病理特征進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌微環(huán)境中趨化因子及其受體差異表達(dá)情況 提取胃癌組織及配對的癌旁正常組織中細(xì)胞總RNA，利用趨化因子表達(dá)譜PCR芯片，測量胃癌中腫瘤組織及癌旁正常組織中趨化因子及其受體的差異表達(dá)情況。芯片中取溶解曲線為單一尖峰的測量孔作為有效數(shù)據(jù)，同時取比值大于2.0或小于0.5的數(shù)據(jù)點為存在顯著表達(dá)差異的基因點，3對組織樣本結(jié)果共測得差異表達(dá)基因49個，其中上調(diào)基因11個，下調(diào)基因38個，CXCL17差異量最大，見圖1。

圖1 胃癌組織相對癌旁正常組織中趨化因子及其受體差異表達(dá)情況

2.2 基因芯片結(jié)果分析 與癌旁正常組織相比，胃癌組織中相關(guān)趨化因子及其受體存在明顯差異表達(dá)情況，按照基因GO的功能分析，這些差異表達(dá)的基因功能主要表現(xiàn)在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及趨化因子調(diào)節(jié)信號通路等，見圖2。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中CXCL17 mRNA表達(dá)差異 通過基因芯片結(jié)果可見胃癌腫瘤組織中CXCL17 mRNA表達(dá)量明顯降低，而CXCL17作為芯片結(jié)果中差異顯著的基因，我們挑選其對芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，我們利用R語言對32個正常組織及376個胃癌組織進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)CXCL17在胃癌組織中表達(dá)量明顯低于正常組織（P＜0.01），其結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。見圖3。

圖2 差異基因生物信息學(xué)功能分類情況

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中CXCL17在胃癌組織中mRNA表達(dá)量明顯降低

2.4 CXCL17在胃癌組織中表達(dá)降低 免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果示胃癌組織中CXCL17蛋白表達(dá)量與正常組織比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果與基因芯片結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗證了基因芯片結(jié)果的真實性與可靠性。見圖4。

2.5 CXCL17蛋白表達(dá)與胃癌病理特征分析 對30例胃癌組織中CXCL17表達(dá)情況及其病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CXCL17與胃癌分化程度密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為腫瘤分化程度越低，CXCL17蛋白表達(dá)越低，低分化組織幾乎不表達(dá)CXCL17蛋白，表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4D。

3 討論

本研究通過表達(dá)譜PCR基因芯片成功篩選出胃癌相關(guān)差異表達(dá)的趨化因子及其受體，并通過生物信息學(xué)分析差異基因的功能主要在于免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及趨化因子調(diào)節(jié)信號通路等方面。在腫瘤微環(huán)境中，多種腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以分泌趨化因子。趨化因子及其受體的定向結(jié)合直接影響著腫瘤發(fā)展和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以識別腫瘤抗原，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫效應(yīng)。隨著腫瘤演進(jìn)，最初的免疫監(jiān)視作用往往被誘導(dǎo)形成免疫耐受，趨化因子在這一過程中發(fā)揮重要作用。大量研究證實了趨化因子及其受體在胃癌中起重要作用，而CCL19/CCL21-CCR7及CXCL12-CXCR4軸的作用尤為突出[6]，CCL19/CCL21-CCR7在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著突出作用，CCR7可能成為特異性評價胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的分子標(biāo)志物[7]，而CXCL12-CXCR4軸在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[8]，阻斷CXCL12-CXCR4軸有助于推動胃癌腹膜轉(zhuǎn)移治療策略的進(jìn)一步發(fā)展。

而我們從差異表達(dá)基因中挑選出了CXCL17做進(jìn)一步的研究與驗證，TCGA數(shù)據(jù)分析及免疫組織化學(xué)結(jié)果分別提示CXCL17在胃癌組織中表達(dá)量明顯降低，且與胃癌分化程度相關(guān)。而CXCL17是趨化因子CXC家族最新發(fā)現(xiàn)的一員，有研究指出，在胰腺癌中，CXCL17的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的提升而降低，而在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中，CXCL17在腫瘤中表達(dá)量上升[9-10]。針對CXCL17在不同腫瘤組織中呈現(xiàn)的不同表現(xiàn)，WEINSTEIN等[11]認(rèn)為CXCL17能夠誘導(dǎo)VEGF相關(guān)因子表達(dá)從而間接促進(jìn)腫瘤血管生成，加速腫瘤生長；HIRAOKA等[12]則認(rèn)為，CXCL17可介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，募集樹突狀細(xì)胞浸潤腫瘤組織，從而產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用。基于上述研究，我們推測CXCL17在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，可能在胃癌中作為一個抑癌角色參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

圖4 CXCL17在胃癌中表達(dá)情況

綜上所述，本研究利用基因芯片測量胃癌微環(huán)境中趨化因子相關(guān)改變，進(jìn)一步驗證了趨化因子及其受體在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。另外，本研究進(jìn)一步完善胃癌中CXCL17的背景資料，并為胃癌的特異性治療提供有力的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。但趨化因子及其受體在免疫反應(yīng)及胃癌發(fā)生發(fā)展中存在極其復(fù)雜的聯(lián)系，尚需在今后的研究中進(jìn)一步進(jìn)行探究。