新型姜黃素納米膠束絲素凝膠的制備及其質量表征

鐘松陽，鄭宏亮，毛凱麗，王思為

（衢州市人民醫院 藥劑科，浙江 衢州 324000）

姜黃素（curcumin，CUR）是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種低分子疏水性多元酚化合物，具有降血脂、抗炎、抗腫瘤等作用，主要作為食用色素使用。近年來研究發現姜黃素能誘導人永生化表皮細胞（HaCaT細胞）凋亡，抑制TNF-α誘導的NF-κB的激活，并減少炎癥因子IL-6和IL-8的分泌，從而對抗銀屑病中TNF-α，具有明顯的抗銀屑病作用[1-2]。但是由于姜黃素溶解度低同時理化性質不穩定導致傳統口服給藥藥物難吸收、生物利用度低。皮膚外用藥物穿透性差，只能滯留在角質層，限制了其在抗銀屑病等慢性皮膚炎癥上的應用。納米藥物載體在遞送藥物至表皮、真皮提高治療部位藥物濃度、減小全身不良反應方面，具有明顯的優勢[3-5]。本研究在前期研究基礎上創新性地將穿透性納米技術和絲素凝膠技術相結合，應用自主合成的新材料兩親性維生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）-接枝-（ε-多聚賴氨酸，polylysine，PLL）（VES-g-PLL）聚合物[6]為膜材制備包載姜黃素的納米膠束（curcumin-loaded nanomicelles，CUR-NMs），提高藥物穩定性、水溶性，改善其皮膚穿透性，繼以絲素凝膠為基質分散納米顆粒，延長藥物在皮膚等局部組織的滯留時間，制備成包載姜黃素的納米膠束絲素凝膠（CURNMs-gel），并對其相關質量指標進行表征，為銀屑病的藥物治療提供新方式。

1 材料和方法

1.1 材料 姜黃素購自上海阿拉丁公司，VES-g-PLL聚合物由實驗室前期合成，水合氯醛購自德國BASF公司，氯倍他索（氯倍他索軟膏0.1%）購自英國葛蘭素史克制藥有限公司，健康雄性BALB/c小鼠（8～11周）購自溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 方法

1.2.1 姜黃素載藥納米膠束的制備：稱取適量姜黃素以及VES-g-PLL聚合物，預先共溶于一定體積的二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）溶液中，在劇烈攪拌下，將上述DMF溶液緩慢滴入至去離子水中自發組裝，在室溫、避光條件下攪拌過夜，將組裝納米粒轉移至透析袋（截留相對分子質量3600 Da）內，用蒸餾水透析、離心，除去未包裹的游離藥物以及有機溶劑，制備載姜黃素納米膠束（CUR-NMs）。空白納米膠束（Bk-NMs）制備方法同上。

1.2.2 粒徑、Zeta電位和形態表征：粒徑、Zeta電位：聚合物納米粒水溶液，過0.8 μm膜，經適當稀釋后，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm、散射角90°，NICOMPTM 380粒度測定儀測定粒徑和Zeta電位。應用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察載體的微觀形態：取上述納米膠束100 μL滴于銅網上有碳膜的一面，以無纖維濾紙從銅網邊緣吸掉多余液體，待完全干燥后，滴入1滴2%磷鎢酸至載有納米粒的銅網上，濾紙吸掉邊緣多余液體，室溫染色，放置自然晾干2 d，置于透射電鏡中以100 kV加速電壓檢視。

1.2.3 載藥量及包封率測定：取0.5 mL載藥納米膠束溶液，置10 mL容量瓶中，加入乙腈、超聲破壞納米結構、稀釋，0.8 μm微孔濾膜過濾，續濾液10 μL進HPLC分析。HPLC條件：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為：甲醇/3 mmol/L磷酸二氫鉀/0.5%醋酸（58∶42∶0.5）；流速1.0 mL/min，檢測波長為227 nm。按照下列公式計算載藥量及包封率：載藥量（%）=[測得藥物重量/（測得藥物重量+載體材料重量）]×100%；包封率（%）=（測得藥物重量/制備時加入藥物）×100%。

1.2.4 姜黃素絲素納米凝膠的制備：蠶繭先在1.5%碳酸鈉溶液中煮沸30 min，然后用蒸餾水清洗去除雜質。洗凈的絲素蛋白在9.3 mol/L溴化鋰溶液60 ℃條件下充分溶解2 h。再把絲素蛋白溶液在透析袋中用蒸餾水透析72 h。最終得到的絲素蛋白溶液濃度約在2%。取制備好的絲素蛋白溶液和CURNMs溶液按體積比1∶1混合，然后用細胞破碎儀超聲（功率50 W）混合溶液1 min得到CUR-NMs-gel。

1.2.5 載藥及空白絲素納米凝膠微觀形態測定：應用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察載藥及空白絲素納米凝膠的表面微觀形態、三維結構。

1.2.6 載藥納米膠束凝膠的體外釋放度測定：應用動態法測定CUR-NMs及CUR-NMs-gel的體外藥物釋放度，過程簡述如下[6]：將1 mL CUR-NMs溶液或CUR-NMs-gel加入到透析袋中（截留相對分子質量3500 Da）。然后將透析袋放入10 mL釋放介質（0.5%吐溫80，pH=7.4 PBS溶液）中，在37 ℃，120 r/min攪拌條件下進行釋放試驗。每個時間點抽取定量釋放介質，應用上述HPLC法測定藥物濃度并及時補充空白釋放介質。

1.2.7 載藥納米膠束凝膠在體皮膚滲透實驗：取健康雄性小鼠，隨機分成2組，除去背部皮膚上的毛發，選取1 cm2添加姜黃素溶液絲素凝膠（CUR-gel）或CUR-NMs-ge（l500 μg姜黃素）。分別于24 h及48 h后斷頸處死小鼠，剝離背部皮膚后，用0.9%氯化鈉溶液反復沖洗干凈，冰凍切片成5 μm厚切片，苯基吲哚染色7 min后激光共聚焦顯微鏡下觀察載藥納米膠束的皮膚滲透深度。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析。計數資料用±s表示，2組間比較采用成組t檢驗，多組間數據比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 載藥納米膠束質量表征 載藥前后納米膠束的微觀形態無明顯變化，空白及載藥納米膠束都呈標準的橢球形，分散性均勻，粘連少。粒徑及Zeta電位檢測結果顯示：空白和載藥納米膠束的平均粒徑分別為（25.23±5.92）nm和（31.14±7.86）nm，而Zeta電位分別為（19.60±1.53）mV和（16.70±1.45）mV，均＞15 mV。制備的載藥納米膠束的包封率及載藥量分別為82.21%±4.32%和3.51%±0.29%。空白及載藥納米膠束的TEM結果見圖1。

2.2 載藥及空白納米膠束絲素凝膠的微觀形態測定結果 未載藥的空白絲素凝膠由許多海綿樣的結構組成，各個海綿樣結構連接在一起形成了絲素凝膠內部的3D網狀結構。而CUR-NMs-gel SEM顯示，CUR-NMs作為一種纖維絮狀物均勻黏附于絲素3D網狀結構的表面，從而起到藥物持續釋放的效果。見圖2。

2.3 CUR-NMs和CUR-NMs-gel的體外藥物釋放度測定 不管是CUR-NMs還是CUR-NMs-gel都沒有明顯的藥物突釋現象。在72 h及pH=7.4的PBS溶液中，大約30%的藥物從載藥納米膠束絲素凝膠中釋放，而大約有49%的藥物從載藥納米膠束釋放，CUR-NMsgel及CUR-NMs體外藥物釋放度測定結果見圖3。

2.4 CUR-NMs-gel在體皮膚滲透 在激光共聚焦顯微鏡下姜黃素顯綠色熒光而細胞核顯藍色熒光。在藥物作用24 h后CUR-gel組小鼠皮膚角質層出現較明顯的綠色熒光，而CUR-NMs-gel組小鼠皮膚角質層綠色熒光較弱，大部分藥物還停留在皮膚表面。72 h后，CUR-gel組綠色熒光仍舊停留在皮膚角質層，幾乎不向深層皮膚滲透；而CUR-NMs-gel組小鼠皮膚72 h后各層皮膚包括角質層、上皮層及真皮層都有綠色熒光信號，且信號分布較均勻。各組大鼠載藥納米膠束凝膠在體透皮實驗結果見圖4。

圖424和48 h后CUR-gel組和CUR-NMs-gel組中CUR在小鼠皮膚中的滲透情況（×200）

3 討論

姜黃素是從姜料等植物的根莖部位提取出的一類二酮類化合物，具有良好的抗炎作用，對于銀屑病等慢性皮膚炎癥疾病具有較好的治療效果[8]。但是其本身存在藥物溶解度低、口服難吸收，皮膚給藥藥物穿透性差等缺陷，使得傳統的給藥劑型和藥物遞送載體并不能滿足臨床需要。本次實驗在前期研究基礎上應用自主合成的新材料VES-g-PLL聚合物作為納米膠束的膜材[9]。該聚合物能自發在水中組裝成表面帶正電荷、粒徑在10～100 nm之間的納米膠束，可用于疏水性藥物姜黃素的包載，提高藥物穩定性、水溶性，改善皮膚穿透性。載藥納米膠束的質量表征結果顯示：本研究制備的載藥及空白納米膠束的平均粒徑均＜50 nm，Zeta電位均為正值且絕對值均大于15 mV，說明本研究制備的空白及載藥納米膠束穩定性好，不易粘連[7]。已有研究證實：表面帶正電荷且粒徑分布在10～100 nm，尤其是粒徑在50 nm以下的納米顆粒能夠顯著促進藥物的皮膚滲透[10-11]。同時包封率測定及體外釋放試驗結果顯示，本次研究制備的載藥納米膠束的包封率高達82.21%±4.32%，且體外釋藥平穩，無藥物突釋現象；載藥量為3.51%±0.29%，包封率及載藥量是評價納米載體性能的重要指標，說明應用新材料制備的納米膠束對于難溶性藥物姜黃素具有較好的載藥能力，可以實現對藥物的高包封。因此本研究應用新材料制備的納米膠束能夠較好地實現對于姜黃素的包載，增加其皮膚滲透能力。

為了進一步增加載藥納米顆粒的緩釋作用同時延長納米載體在皮膚的停留時間，本研究還將載藥納米膠束分散到絲素水凝膠中。絲素凝膠是指利用絲素蛋白的物理性質形成凝膠，它可以有效地增加藥物的有效負載，延長藥物在皮膚的滯留時間，在人體內產生控釋、緩釋、靶向、降低毒性等特點；可實現長期釋藥，廣泛應用于皮膚局部給藥、眼部給藥、鼻部給藥、直腸給藥以及注射給藥，在藥學領域中發揮著重要的作用[12-14]。本研究將載藥納米膠束進一步與絲素蛋白水凝膠混合制備CUR-NMsgel。CUR-NMs-gel的SEM觀察結果可以證實：載藥納米膠束以絮狀物形式黏附于絲素蛋白的3D網狀結構表面（這可能是由于載藥納米膠束帶正電荷而絲素纖維蛋白帶負電荷二者產生靜電吸附作用），從而使得載藥納米膠束吸附于絲素凝膠的網狀結構表面，從而起到更好的藥物緩釋效果。載藥納米膠束及其水凝膠的體外釋藥實驗也證實，相比于單純的納米膠束包載，應用絲素水凝膠結合納米膠束能夠進一步實現姜黃素的緩釋效果。另外本研究還考察了載藥納米膠束絲素凝膠的在體皮膚滲透試驗，結果證實：單純的姜黃素溶液與絲素凝膠混合只能將藥物滲透到皮膚的角質層，而應用載藥納米膠束結合絲素凝膠能夠將藥物遞送到皮膚各個層面包括角質層、上皮層及真皮層，從而發揮藥物治療效果。

綜上所述，應用新材料VES-g-PLL制備的載藥納米膠束結合絲素凝膠能夠實現難溶性藥物姜黃素的緩釋及透皮吸收，有望成為治療銀屑病等慢性皮膚炎癥疾病的一種新方法。