紅景天苷對誘導的成骨細胞在低氧環境中的保護作用

沈新升，陳鷗，賴憲良，蘇嘉

（溫州市中西醫結合醫院 骨科，浙江 溫州 325000）

骨缺損是臨床治療中常見的難題，組織工程學細胞經分化后提供分化的成骨細胞[1-3]，這些細胞具有成骨細胞的生理功能，是目前研究的熱點。但這些誘導的細胞隨著分化增殖的代數增多，表現出衰老的跡象，不能很好地維持自身的功能，給臨床轉化帶來了限制。誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPS細胞）是能無限制定向分化為各種間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的種子細胞[4]。目前已有將IPS細胞分化為成骨細胞的報道[5-7]。然而IPS細胞在低氧環境中的生理狀態及能否發揮生理作用目前尚不清楚，有報道認為紅景天苷對細胞在低氧環境中有保護作用[8]。本研究對IPS誘導的成骨細胞分成正常組、低氧組、紅景天苷預處理組，探討紅景天苷對IPS誘導的成骨細胞在低氧環境的生理狀態的保護作用以及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠胚胎成纖維細胞購自上海典藏細胞庫，293T細胞購自上海斯丹賽生物技術有限公司，BALB/c型4周齡小鼠購自溫州醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SYXY（浙）2010-0150，實驗在溫州市中西醫結合醫院細胞實驗中心進行。含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF4的慢病毒質粒由廣州四和公司包裝， II型膠原蛋白酶和胰酶（美國Sigma公司），胎牛血清、DMEM/F12培養基、100×青鏈霉素（美國Gibco公司），抗壞血酸、甘油磷酸、地塞米松（美國Sigma公司），β-actin抗體（美國Proteintech集團），RIPA細胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、DAB發光液、TBST液（上海碧云天公司），FITC/PI試劑盒（美國Sigma公司）。紅景天苷（純度＞99%，中國藥品生物制品鑒定所）。低氧誘導因子-1（hypoxia induced factor-1，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（美國Sigma公司），聚凝胺溶液（上海碧云天公司），Defined FBS（美國Gibco公司）。內源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR檢測試劑盒由廣州四和公司提供。

1.2 成纖維細胞分離培養方法 將BALB/c型小鼠夾頭處死，剝取皮膚，剔去皮下組織、血管和血跡，含1%青鏈霉素的PBS 30 mL沖洗3次，每次30 s。采用組織塊法，將皮膚剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織塊，接種于75 mL培養瓶中，2 mg/mL II型膠原蛋白酶消化，于5% CO2、21% O2、37 ℃條件下過夜，PBS液清洗后，0.25%胰酶消化，用含胎牛血清的DMEM/F12清洗，1500×g離心10 min，取上清液加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接種于培養瓶中。每2～3 d更換DMEM/F12培養液1次。等細胞爬滿培養瓶底部約占80%時，胰酶消化傳代。收集第三代培養細胞。

1.3 小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）滋養層制備方法 取MEF，0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接種于培養瓶中。爬滿80%瓶底后，加入4 mL 10 μg/mL的絲裂霉素C處理MEF細胞2 h，棄掉絲裂霉素C，PBS清洗2次，用0.1%基質膠預處理，轉移至培養瓶中。

1.4 IPS細胞的誘導和培養方法 采用磷酸鈣轉染法將含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF44種cDNA的慢病毒質粒轉染到293T細胞中，提取病毒上清液。取等體積病毒上清液和4 mg/L聚凝胺溶液混合，替換成纖維細胞培養基，5% CO2、21% O2、37 ℃培養箱中孵育6 h。將誘導的細胞以1×105個/mL的密度接種于失活的MEF上48 h后，培養基改換成Defined FBS，置于37 ℃，5% CO2培養箱培養，每72 h傳代一次，取第三代細胞，按照說明書進行小鼠成纖維細胞行內源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR檢測。

1.5 IPS細胞誘導為成骨細胞方法 取第三代培養的細胞，經過離心機分離，然后用0．25%胰蛋白酶處理成單細胞轉移到含有明膠涂層的培養皿上進行懸浮培養，培養液為成骨分化培養液，其包含50 μg/mL抗壞血酸，lO nmol/L地塞米松，5 mmol/L 3-甘油磷酸。培養液每3 d換1次，細胞在第21天時按照實驗試劑說明書進行茜素紅染色。

1.6 分組方法 誘導后的成骨細胞分成3組（對照組、低氧組、紅景天苷預處理組）。對照組于5% CO2、21% O2、37 ℃條件下培養12 h。低氧組于5% CO2、0.5% O2、37 ℃條件下培養12 h。紅景天苷預處理組于5% CO2、5% O2、37 ℃條件下在含1 mg/L的紅景天苷培養液中培養24 h，轉移至5% CO2、0.5%O2、37 ℃條件下繼續培養12 h（其余條件不變）。

1.7 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡率 用胰酶+EDTA混合液消化細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，按試劑盒操作說明書操作，計算FITC單染（Q3）與-FITC/PI雙染（Q2）的陽性細胞百分數之和作為該樣品細胞凋亡百分數。

1.8 Western blot檢測VEGF和HIF-1α表達量 分組提取細胞總蛋白，按照VEGF和HIF-1α的Western blot檢測的實驗試劑盒操作說明書步驟操作，運用Bio-Rad公司的Quantity One軟件對Western blot結果進行圖像分析。

1.9 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IPS細胞內源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2表達結果 重編程的細胞的干細胞標志物內源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS細胞中的表達量明顯高于在小鼠成纖維細胞中的表達量，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 IPS細胞內源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS細胞和成纖維細胞中的表達量

2.2 IPS細胞成骨定向分化后的細胞茜素紅染色結果 IPS細胞成骨定向分化后的細胞茜素紅染色表達陽性，見圖2。

圖2 IPS細胞成骨定向分化后細胞染色結果（茜素紅染色，×200）

2.3 3組誘導后的成骨細胞Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡率比較 正常組細胞組凋亡率為0.88%±0.18%，紅景天苷預處理組為35.65%±3.92%，低氧組凋亡率為95.20%±1.03%。正常組和紅景天苷預處理組凋亡率低于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常組凋亡率低于紅景天苷預處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖33組誘導后的成骨細胞凋亡率Annexin V-FITC/PI檢測分析圖

2.4 3組誘導后的成骨細胞VEGF和HIF-1α蛋白水平比較 紅景天苷預處理組VEGF蛋白表達量高于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）。紅景天苷預處理組HIF-1α蛋白表達量高于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）。正常組的VEGF蛋白表達量高于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）。正常組的HIF-1α蛋白表達量高于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

研究發現，IPS細胞經培養誘導后，能誘導出符合成骨細胞生物學活性和表型的細胞。OKAMOTO等[9]用2-硫基乙醇和抗白血病因子將IPS細胞定向分化成成骨細胞。錢浩等[10]用抗壞血酸、地塞米松和3-甘油磷酸等將IPS細胞定向分化成成骨細胞。茜素紅染色是成骨細胞的特異性染色檢測。本研究中重編程的細胞的Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的表達明顯高于成纖維細胞的表達，說明重編程的細胞具有IPS細胞的特征。而重編程的細胞經誘導后，茜素紅染色陽性，表明誘導后的細胞成骨分化程度高。因此可以認為重編程的IPS細胞能定向誘導分化為成骨細胞。

圖43組誘導后的成骨細胞HIF-1α和VEGF的蛋白表達

種子細胞在低氧環境中是否可以存活，目前仍存在著爭論。GENG[11]將MSCs注射到發生心肌梗死小鼠的心室，4 d后99%的MSCs死亡，表明缺血缺氧環境中細胞存活困難。但FOLLMAR等[12]發現在0.1%O2（極度低氧）下兔來源的干細胞死亡增多，但在有限的氧濃度下細胞依舊可以存活。給予適當的干預，提高細胞的抗凋亡能力，有助于提高低氧環境中細胞的生存能力。

HIF-1是缺氧條件下傳遞缺氧信號、介導缺氧效應的關鍵轉錄因子，通過與缺氧相關反應元件結合，刺激下游相關基因表達，促進血管生成。HIF-1的結構由HIF-1α和HIF-1β組成，其中HIF-1α發揮主要的生物學活性。紅景天苷是從中藥紅景天中提取的化學成分，在減輕缺氧癥狀和抗氧化方面具有重要作用[13]。李慶勇等[14]發現在低氧情況下，組織的HIF-1α表達會增加，然而在本研究中，低氧組的誘導后成骨細胞表達HIF-1α低于正常組。這可能是由實驗設計中低氧的濃度不同，同時HIF-1α極不穩定，容易丟失等情況引起。在本研究中，紅景天苷預處理組的HIF-1α表達高于低氧組，差異有統計學意義；其與正常組比較差異無統計學意義，表明紅景天苷能提高細胞的HIF-1α的表達，并對HIF-1α起到穩定的作用，與STEGEN等[15]的研究結果一致。

VEGF是HIF-1α的下游基因，HIF-1α的增加能促進VEGF的表達。在本研究中發現誘導的成骨細胞在紅景天苷預處理組與低氧組比較時，VEGF表達升高，表明紅景天苷通過提高誘導后成骨細胞HIF-1α的表達，間接促進VEGF的表達。有研究[16-17]認為VEGF可以抑制細胞的凋亡，改善細胞的狀態。本研究Annexin V-FITC/PI凋亡率檢測實驗結果顯示，紅景天苷預處理組的成骨細胞凋亡率明顯低于低氧組。KLUCK等[18]發現在細胞凋亡早期，給予刺激因素可以挽救細胞，使其恢復正常的生理。因此，本研究認為用紅景天苷預處理的方法可以提高低氧情況下誘導后成骨細胞的生理狀態，對誘導的成骨細胞有保護作用，其機制可能為紅景天苷通過提高誘導后成骨細胞HIF-1α的表達，間接促進VEGF的表達，發揮抑制誘導的成骨細胞凋亡的作用。