綠汁發酵液中的微生物多樣性及其對菌糠發酵品質的影響

陳鑫珠, 高承芳, 劉 景*, 陳炳鈿, 黃勤樓, 黃秀聲, 翁伯琦*

(1. 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所, 福建 福州 350013； 2. 福建省新閩科生物科技開發有限公司博士后科研 工作站, 福建 福州 350008； 3. 福建省農業科學院生態研究所, 福建 福州 350013)

21世紀以來，我國社會經濟快速發展，飼料市場需求不斷提高，新型飼料開發顯得尤為重要[1]。近年來，我國食用菌的產量逐漸增加，使得菌糠(mushroom bran)的產量也隨之增加，這也使得開發菌糠飼料資源成為研究熱點[1]。青貯(silage)是將新鮮的牧草或秸稈等飼料作物，利用其表面附生的乳酸菌發酵成一種青綠多汁、耐貯存、可供動物全年均衡營養配方飼料的方法。國外對青貯研究的比較早，對一些青貯原料所含可溶性碳水化合物缺乏和附著在其上的乳酸菌數目不足是導致青貯失敗，開展了青貯劑的篩選、發酵效果及品質評價等方面的研究[2]。綠汁發酵液(Fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria,FJLB) 是近年來新研發的一種新型生物性青貯添加劑，類似于乳酸菌制劑。其本質是將植物勻漿后，利用其表面附生的乳酸菌在厭氧環境中將植物綠汁中的乳酸菌發酵富集，制成的一種青貯添加劑。其最大特點是經濟和環保，制作工藝流程簡單、生產成本低、操作時安全，無污染，比一些商品乳酸菌制劑穩定，且不受飼草生長季節、水分含量及發酵溫度的影響[3]。近年來，逐漸成為研究的熱點。在青貯料中添加綠汁發酵液可以迅速降低pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動，減少低蛋白質損失，且其添加效果不受青貯原料、DM含量及青貯條件影響[4]。添加綠汁發酵液可顯著地提高苜蓿青貯料的營養價值。Ohshima等[5]認為，綠汁發酵液作用于苜蓿青貯不受收獲季節、生育期以及貯存溫度的影響，其青貯效果較好。但是，綠汁發酵液穩定性較弱，不宜長期保存，在實際大規模生產中使用較少，其優劣性還有待進一步研究。本試驗正是為探究影響其作用的微生物組成情況進行分析，為探究其穩定性影響因素奠定理論基礎。

傳統培養法是經典的微生物研究方法，但是在分子生物技術快速發展的今天，采用傳統培養法研究微生物群落結構、種群多樣性及變化有其局限性，費時和費力，且結果片面，無法充分解析樣品中微生物的種類、豐度及其變化情況，低估了微生物的多樣性[6]。隨著分子生物學技術的發展和更新換代，16S rRNA克隆建庫、限制性片段長度多態性(RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、脈沖電泳等方法也無法滿足科研分析的需要。基于微生物宏基因組學的高通量焦磷酸測序技術具有高通量、快速、省力等優點，已逐漸被廣泛應用于土壤、腸道、水體、發酵食品等各微生態環境中微生物多樣性的檢測和研究，成為研究的熱點[7]。采用高通量測序技術檢測和分析綠汁發酵液中微生物多樣性還未有報道。因此，本試驗利用宏基因組學技術，研究不同綠汁發酵液中的微生物多樣性，為全面了解不同綠汁發酵液中的微生物組成情況、有益微生物種類、提高青貯飼料營養價值和品質提供理論基礎和新方法；另外，本試驗以菌糠為發酵原料，調制菌糠青貯飼料，為菌糠飼料的開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

菌糠：栽培平菇(Pleurotusostreatus)后的菌糠，由福建農林大學菌草研究所提供。配方：五節芒(Miscanthusfloridulus(Labnll.)Warb)73% 麩皮25%，石灰2%，含水量60%。

紅象草(Pennisetumpurpureumred‘Red’)、甜玉米(ZeamaysL.)秸稈和葛藤(Puerarialobata(Willd.)Ohwi.)原料由泉頭牧草基地種植，甘蔗(Saccharumofficinarum)梢由市場購買的果蔗取末梢2～3節。

1.2 綠汁發酵液的制作

2015年7月20日紅象草(Red elephant grass，PEG)、甜玉米秸稈(corn stalk，CS)、菌糠(mushroom residue，MB)、葛藤(kudzu，K)和甘蔗梢(sugarcane top，SC)。綠汁發酵液的制備參照Bureenok等報道的方法[8]。每個材料制備3瓶綠汁發酵液，即3個重復。

1.3 菌糠青貯飼料的制作

將采集到的菌棒破膜、搗碎、混合均勻。稱取18份500 g菌糠原料，分別裝入30 cm×45 cm自封袋中，試驗自封袋貼好標簽，分別均勻噴灑前期制作的五種綠汁發酵液(每種3個重復，共15份)，添加量為2 mL·kg-1綠汁發酵液+ 8 mL·kg-1蒸餾水，3份對照組處理噴灑等體積的蒸餾水，再充分混勻后裝入青貯袋中，抽真空、封口。放置室溫，發酵30開封。對照組和五種添加劑處理共6個處理18份，即每個處理3重復。

1.4 原料特性及發酵品質的測定

原料分析樣本按常規方法測定水分和粗蛋白質含量[9]；緩沖能的測定采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[10]；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量的測定參照Van Soest方法[11]，半纖維素(hemicellulose，HC)=中性洗滌纖維-酸性洗滌纖維。可溶性碳水化合物(water soluble-carbohydrates，WSC)含量是用比色法[12]測定的。

分別采用MRS瓊脂培養基(MRS agar medium，MRS)、營養瓊脂培養基(Nutrient Agar，NA)計數發酵液上的乳酸菌。乳酸菌用厭氧箱(YQX-Ⅱ型，上海新苗)，37℃培養2 d。

青貯料開封后，攪拌均勻，每個樣本稱20 g放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80 mL蒸餾水，放置4℃冰箱浸泡18 h后離心，用pH計(pH計：pHS-3B，上海鵬順科學儀器有限公司)測上清液的pH值；準確量取10 mL上清液，采用凱氏定氮儀測定氨態氮(NH3-N)含量[9]；采用島津LC-20AT型高效液相色譜儀測定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyrate acid，BA)含量。

WSC、NDF、ADF、HC、CP、LA、AA、PA和BA含量以干物質基礎的百分比表示。

1.5 綠汁發酵微生物菌群分析

1.5.1綠汁發酵液總微生物菌體的收集將制備好的綠汁發酵液，搖勻后，取40 mL到滅菌后的離心管，1 000 rpm離心5 min，取上清液到另一只干凈的無菌管，12 000 rpm離心5 min，收集菌體沉淀。

1.5.2細菌基因組DNA的提取 每個菌體樣品按照FastDNA? SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國)試劑盒的說明，進行發酵液總細菌基因組DNA的提取，并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.5.316S rDNA的擴增和測序 使用上述提取的總DNA作為PCR的模板，利用特異性的引物對338F和 806R擴增細菌 16S rDNA基因序列高變區V3～V4區，同時在前引物 5’端添加Barcode序列區分樣品[13]。每個樣品 3次重復，將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。16S rRNA基因測序文庫構建和Illumina Miseq測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 數據統計分析

1.6.1生物信息學分析 序列分析由QIIME軟件包和UPARSE pipeline完成。首先原始序列通過QIIME的默認參數過濾掉低質量的序列；然后利用UPARSE軟件生成OTU(Operational Taxonomic Units)(序列相似度≥97%)，利用RDP從每個OTU中選擇一條序列作為OTU代表；根據獲得的OTU數據，以測序樣本的序列數為橫坐標，OTU值作為縱坐標繪出每個樣品的稀釋曲線，同時根據樣本中所共有和獨有的OTU數目作OTU分布圖。稀釋曲線及α-多樣性的Chao指數和Shannon指數等生物多樣性指數由mothur軟件平臺(version v. 1. 30. 1，http:/ /www. Mothur. org /wiki /Schloss _ SOP # Alpha _diversity)完成。熱圖(Heatmap)、主成分分析圖(PCA) 和冗余分析(RDA)采用R語言相關軟件包進行分析作圖。

1.6.2青貯數據統計分析 用Excel對數據進行整理，采用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析，采用Duncan法對均值進行多重比較，對材料特性進行分析。

2 結果與分析

2.1 五種原料的化學成分及微生物組成

五種原料的化學成分及微生物組成見表1。菌糠的干物質含量和粗脂肪含量顯著高于(P<0.05)其他4種原料，緩存能和半纖維素含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；葛藤pH值、緩沖能、粗蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)低于其他4種原料；甘蔗梢的半纖維素含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，粗脂肪含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；玉米秸稈和甘蔗梢的可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)高于其他3種原料。5種原料微生物總量中，菌糠的乳酸菌、好氣性細菌、酵母菌和霉菌的數量顯著(P<0.05)低于其他4種原料。

表1 五種原料的化學成分及微生物組成Table 1 The chemical and microorganism composition of five materials

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

Note:Different lowercase letter in the same column indicated significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 五種綠汁發酵液中的微生物OTU alpha多樣性分析

2.2.1五種綠汁發酵液中的多樣性指數分析 如圖1所示，Shannon稀釋曲線顯示曲線已經趨于平坦，其覆蓋度均達到96%以上(表2)，表明樣本測序量已經飽和，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。基于OTU的結果，計算樣品的alpha豐富程度，葛藤和甘蔗梢綠汁發酵液的OTU數量，葛藤綠汁發酵液的Chao1和ACE值顯著(P<0.05)高于玉米秸桿、紅象草和菌糠綠汁發酵液，葛藤和菌糠綠汁發酵液的Shannon值和npShannon值顯著高于玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發酵液，玉米秸稈和甘蔗梢的Simpson值顯著高于葛藤、紅象草和菌糠綠汁發酵液(表2)。葛藤綠汁發酵液的Chao1、ACE、Shannon和npShannon指數等指標上均處在較高的水平，Simpson指數處在較低水平，說明葛藤綠汁發酵液的菌群數量較大，多樣性水平也相對較高。

圖1 樣品的shannon稀釋曲線圖Fig.1 Multy samples Shannon-wlener Curves注：corn，玉米秸稈；kudzu，葛藤；PEG，紅象草；MB，菌糠；SC，甘蔗梢；1，2，3，表示樣品的3個重復；下同Note:PEG,red elephant grass;MB,mushroom bran;SC,sugarcane;1,2,3 means three duplicates of the samples;The same as follow

表2 五種綠汁發酵液Alpha豐富程度表Table 2 The alpha diversity of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria

Number of OTUschao1ACEShannonnpShannonSimpsonCoverageCorn2711.33±58.18b6203.19±637.79c9622.11±943.20bc3.42±0.20c3.59±0.20c0.15±0.03a0.97Kudzu3580.67±74.14a7712.72±84.41a11865.80±303.76a4.02±0.25a4.19±0.27a0.10±0.02b0.96PEG2766.00±507.71b6258.08±1093.10bc9501.77±1573.24b3.86±0.09ab4.01±0.10ab0.09±0.02b0.97MB2877.33±230.97b6312.08±507.62bc9778.15±325.20b4.04±0.10a4.21±0.10a0.08±0.00b0.96SC3449.67±126.23a7405.40±37.40ab11128.47±146.83ab3.60±0.13bc3.77±0.12bc0.17±0.03a0.97F7.404.194.698.047.5810.02P0.010.030.020.000.000.00

2.2.2五種綠汁發酵液中微生物多樣性主成分分析 五種綠汁發酵液15個樣品的主成分分析見圖2。三個重復的樣品點聚集在一起，表示三個樣品重復性好。PC1的貢獻率為30.7%，PC2的貢獻率為25.9%。根據主成分分析，五組樣品大致可分為三類，紅象草和菌糠綠汁發酵液兩組樣品分別落在第一和第四象限，和其他組樣品的距離相對較遠，單獨一類，甘蔗梢和玉米秸稈綠汁發酵液兩組樣品落在第二象限，葛藤落第三象限，三組樣品均分布在X軸附近，距離較近，歸類為一類。

圖2 樣品的PCA圖(OTU水平)Fig.2 Principal component analysis of microbial community of the samples (OUT level)

2.2.3五種綠汁發酵液中微生物多樣性熱圖分析 根據OTU的表達譜數據，使用熱圖來展示不同的OTU在各樣品間的表達變化情況，同時可以根據熱圖上的聚類關系，也可以反應樣本關系。因為OTU的數目較多，且多數OTU豐度都很低(包含tags數量為1)，所以我們使用OTU至少在一個樣本中包含tags數量達到總tags數量的0.1%作為閾值，對滿足該條件的OTU進行熱圖分析。圖3中五種綠汁發酵液的熱圖明顯呈現出五種原料微生物優勢菌株的差異性。五種綠汁發酵液的3個重復均能較好的聚集在一起，說明樣品的重復性較好。玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發酵液首先聚為一類，說明其二者菌群相似度較高，之后再與葛藤聚為一類；紅象草和菌糠綠汁發酵液單獨聚為一類。

2.2.4五種綠汁發酵液中物種分類樹展示 根據物種的分類表達譜的數據，選取豐度較高的部分物種分類單元，我們做出了物種分類樹的展示圖。餅圖中不同的顏色的區域代表不同的樣品在該分類單元上的比率，半徑的大小代表該分類單元所包含的tag數占總tag的比例，半徑越大代表豐度越高，餅圖旁邊的百分比代表該分類單元的tag數占總tag數的百分比。

如圖4所示，綠汁發酵液微生物為細菌(99.804%)，主要為變形菌門(proteobacteria)(60.735%)的γ-變形菌綱Gamaproteobacteria(58.993%)和厚壁菌門(Firmicutes)(38.666%)的桿菌綱(Bacilli)(38.662%)。γ-變形菌綱主要是假單胞菌目(Pseudomonadales)(13.861%)下假單胞細菌科(Pseudomonadaceae)(13.475%)的假單胞屬(Pseudomonas)(11.952%)和腸桿菌目(Enterobacteriales)(43.846%)下腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(43.846%)的歐文氏菌屬(Erwinia)(7.556%)、克雷白氏桿菌屬(Klebslella)(12.128%)、沙雷氏菌屬(Serratia)(11.952%)、檸檬酸細菌屬(Citobacter)(1.467%)、沙門氏菌(Salmenella)(6.450%)和腸桿菌屬(Enterobacter)(0.303%)；桿菌綱主要是桿菌目(Lactobacillales)(38.075%)明串珠菌科(Leuconostocaceae) 的明串珠菌屬(Leuconostoc)(30.751%)和魏斯氏菌屬(Weissella)(1.45%)，以及鏈球菌科(Streptococcaceae)(7.153%)的乳球菌屬Lactococcus(7.117%)。其中玉米秸稈綠汁發酵液中克雷白氏桿菌屬和明串珠菌屬比例較高，菌糠綠汁發酵液中檸檬酸細菌屬、沙門氏菌和腸桿菌屬比例較高，葛藤和紅香草綠汁發酵液中乳球菌屬比例較高，另外葛藤綠汁發酵液中腸桿菌屬比例較高。

圖3 樣品OTU表達譜熱圖Fig.3 OTU heat map of samples

圖4 樣品菌群的發育樹Fig.4 Species classification tree of samples

2.3 不同水平下微生物群落結構分析

2.3.1基于目水平的微生物群落結構分析 五種綠汁發酵液基于目水平下的微生物群落結構見圖5(豐度>1%)。圖5顯示了15個樣本共鑒定出60個目，豐度大于1%的目只有4個，總豐度分別占98.47%(玉米秸稈)，97.43%(葛藤)，97.15%(紅象草)，96.82%(菌糠)和96.07%(甘蔗梢)，其中乳酸桿菌目(Lactobacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)為優勢菌目，伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)在各組樣品中占的比例較低，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細菌。不同原料所制得綠汁發酵液目水平的微生物分布比例差異明顯。玉米秸稈和紅象草綠汁發酵液中優勢菌目為腸桿菌目和乳酸桿菌目，分別占48.34%和35.73%；葛藤綠汁發酵液中乳酸桿菌目、腸桿菌目和假單胞菌目三者為優勢菌目，分別占35.52%、31.50%和29.61%；菌糠綠汁發酵液中優勢菌目為腸桿菌目，占71.48%；甘蔗梢綠汁發酵液中優勢菌目為乳酸桿菌目，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖5 基于目水平的樣本微生物群落結構Fig.5 Microbial community structure of sample on the order level注：堆疊圖展示至少在一個樣本中的表達豐度達到1%的物種，達不到1%的物種統一歸類到Other類別中去，無法注釋到該水平的tags則被歸類到Unclassified類別中去；下同Note:The stack diagram shows the species that expression abundance reached 1%,the species less than 1% were classified into Other categories,the tags unable to comment are classified into the Unclassified category;The same as below

2.4.2基于科水平的微生物群落結構分析 五種綠汁發酵液基于科水平下的微生物群落結構見圖6(豐度>1%)。圖6顯示了15個樣本共鑒定出90個科，豐度大于1%的科只有4個，分別為明串珠菌科(Leuconostocaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細菌。4個科的菌總豐度分別為97.41%(玉米秸稈)，95.61%(葛藤)，95.89%(紅象草)，94.54%(菌糠)和93.28%(甘蔗梢)。不同原料所制得綠汁發酵液不同科水平的微生物分布比例有明顯差異。玉米秸稈綠汁發酵液中優勢菌科為明串珠菌科和腸桿菌科，分別占32.86%和48.34%；葛藤綠汁發酵液中明串珠菌科、腸桿菌科和假單胞菌科三者為優勢菌目，分別占34.70%、31.50%和28.90%；紅象草和菌糠綠汁發酵液中腸桿菌科為優勢菌科，分別占53.02%和71.48%；甘蔗梢綠汁發酵液中優勢菌目為明串珠菌科，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖6 基于科水平的樣本微生物群落結構Fig.6 Microbial community structure of sample on the family level

2.4.3基于屬水平的微生物群落結構分析 五種綠汁發酵液基于屬水平下的微生物群落結構見圖7(豐度>1%)。圖7顯示了15個樣本共鑒定出129個屬，豐度大于1%的屬有9個，分別為明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細菌。9個屬菌總豐度分別為85.40%(玉米秸稈)，60.15%(葛藤)，77.74%(紅象草)，72.68%(菌糠)和42.31%(甘蔗梢)，葛藤和甘蔗梢綠汁發酵液中含有較大比例無法注釋的菌屬。不同原料所制得綠汁發酵液菌屬種類和分布比例有顯著差異。在可注釋的這些菌屬中，玉米秸稈綠汁發酵液中優勢菌屬為明串珠菌屬(29.81%)、克雷白氏桿菌屬(31.96%)和假單胞菌屬(11.85%)，另外，與青貯相關的乳球菌屬占2.75%；葛藤綠汁發酵液中優勢菌屬為假單胞菌屬(26.82%)，明串珠菌屬(6.97%)、魏斯氏菌屬(2.21%)和沙門氏菌屬(1.80%)；紅象草綠汁發酵液中乳球菌屬(28.12%)和沙雷氏菌屬(23.08%)為優勢菌屬，另外，與青貯相關的明串珠菌屬占10.17%；菌糠綠汁發酵液優勢菌屬為沙門氏菌屬占31.71%，另外，與青貯相關的明串珠菌屬占6.09%；甘蔗梢綠汁發酵液中50%以上菌屬無法注釋，含有與青貯相關的菌屬有明串珠菌屬(9.43%)、乳球菌屬(3.44%)和魏斯氏菌屬(2.71%)。

2.4 五種綠汁發酵液對菌糠發酵品質的影響

2.4.1五種綠汁發酵液對菌糠發酵料干物質、氨態氮和pH的影響 五種綠汁發酵液對菌糠干物質、氨態氮和pH的影響見圖8。各處理組干物質含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，菌糠綠汁發酵液處理組的干物質含量顯著(P<0.05)高于紅象草、葛藤和甘蔗梢綠汁發酵液組；與對照組相比，菌糠綠汁發酵液處理組的氨態氮含量顯著(P<0.05)降低；與對照組相比，五種綠汁發酵液組的pH顯著(P<0.05)降低，紅象草綠汁發酵液處理組的pH顯著(P<0.05)低于其他處理組。

2.4.2五種綠汁發酵液對菌糠發酵料有機酸的影響 五種綠汁發酵液對菌糠發酵料有機酸的影響見圖9。與對照組相比，五種綠汁發酵液處理組青貯料的乳酸含量顯著(P<0.05)升高，丁酸含量顯著(P<0.05)降低；除紅象草綠汁發酵液處理組外，其他四種綠汁發酵液處理組的乙酸含量顯著(P<0.05)降低；紅象草綠汁發酵液處理組的丙酸含量顯著(P<0.05)降低。

圖7 基于屬水平的樣本微生物群落結構Fig.7 Microbial community structure of sample on the genus level

圖8 五種綠汁發酵液對干物質含量、氨態氮含量和pH值的影響Fig.8 The effect of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria on dry matter content,ammonia-N content and pH value注：CK，對照組；PEG，紅象草綠汁發酵液處理組；Corn，玉米綠汁發酵液處理組；MB，菌糠綠汁發酵液處理組；Kudzu，葛藤綠汁發酵液處理組；SC，甘蔗梢綠汁發酵液處理組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同Note:CK,control;PEG,adding red elephant grass fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB) group;MB,adding mushroom bran FJLB group;Kudzu,adding kudzu FJLB group;SC,adding sugarcane FJLB group;Different lowercase letter indicated significant difference at the 0.05 level (P<0.05);The same as below

圖9 五種綠汁發酵液對有機酸的影響Fig.9 The effect of five fermented juice of epiphytic LAB on the contents of organic acid

2.5 冗余分析

采用冗余分析綠汁發酵液乳酸菌菌屬與青貯發酵產物的相關性等結果見圖10。pH、氨態氮坐落在第一現象，與分布在第一象限的腸球菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬呈銳角，為正相關；丁酸在第二象限，與分布在第二象限和第三現象的片球菌屬和明串珠菌屬呈銳角，為正相關，且射線較長，相關系數較高；乳酸和乙酸在第三象限，與分布在第三象限的明串珠菌屬、Y軸負半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關，且相關系數較高；干物質和丙酸分布在第四象限，與Y軸負半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關，且相關系數較高。

采用冗余分析綠汁發酵液乳酸菌菌種與青貯發酵產物的相關性等結果見圖11。腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的射線最長，對青貯有機酸的影響最大。丁酸和乳酸在第一象限，與腸系膜明串珠菌呈銳角，為正相關；氨態氮在第二象限，靠近X軸負半軸，與附近的嗜酸球菌(Pedococcusacidilactici)、干酪腸球菌(Enterococcuscasselillvus)、細辛腸球菌(Enterococcusasini)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、葡萄魏氏菌(Weissellaviridescens)和格氏乳球菌(Lactococcusgarviease)呈銳角，為正相關；pH在第三現象，與第三象限上的嗜酸球菌、干酪腸球菌、細辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌、硫腸球菌(Enterococcussulfureus)和格氏乳球菌呈銳角，為正相關；干物質、乙酸和丙酸在第四象限，與無乳鏈球菌呈銳角，為正相關。

圖10 屬水平上的RDA分析Fig.10 RDA analysis on the genus level

圖11 種水平上的RDA分析Fig.11 RDA analysis on the specie level

3 討論

青貯主要是利用原來中的乳酸菌進行厭氧發酵，使的青貯料成為一個酸性環境，而酸性環境能夠有效抑制有害微生物的生長繁殖，從而保存原料的營養物質[14-17]。許多原料附生的乳酸菌數量較少，添加乳酸菌制劑是人工擴大青貯原料中乳酸菌群體的有效方法[18-19]。本次試驗結果表明，試驗原料菌糠中的乳酸菌數量較少，僅2.23 lg cfu·g-1FM。一般來說，使乳酸菌迅速增殖并占主導地位的原料中，乳酸菌的有效濃度以105·g-1鮮草為標準值[20]。本試驗菌糠原料遠低于這個標準值，因此必須采用人工添加乳酸菌制劑的方法進行發酵。綠汁發酵液是人工制成的一種新型的純天然的青貯添加劑。Naoki[4]，Ohshima[21]等報道在青貯料中添加綠汁發酵液可以迅速降低青貯料的pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動，減少蛋白損失，且其添加效果不受青貯原料、收獲季節、生育期、干物質含量及青貯條件影響，其青貯效果較好。鄭丹等[22]表明，添加綠汁發酵液后促進同質乳酸菌的發酵，有效地抑制了丁酸菌及其他有害微生物活性，減少了蛋白質的分解，提高了乳酸菌對水溶性碳水化合物的利用效率及雜交狼尾草青貯發酵品質。本試驗也獲得相似結果，五種綠汁發酵液能夠有效的改善菌糠的發酵品質，提高菌糠青貯料的乳酸含量，降低了其pH值、乙酸含量和丁酸的含量。這與Shao[23]在黑麥草中，許慶芳[24]等在苜蓿中，葉杭等[25]香蕉葉中添加綠汁發酵液的效果相似。

綠汁發酵液其實質是人工培養法對原料表面附生的乳酸菌在無氧條件下進行自然富集，因此可作為乳酸菌菌劑的替代物。Cai等報道[26]，與青貯密切相關的乳酸菌主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)，片球菌屬(Pediococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，明串珠菌屬(Leuconostoc)，乳球菌屬(Lactococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，魏斯特菌屬(Weissella)。這些菌屬中的菌株能夠在厭氧條件下，進行乳酸發酵，產生乳酸，降低青貯料的pH值，從而抑制一些需氧的不良細菌的生長繁殖，保存青貯料的營養物質。本試驗對菌屬與青貯發酵品質進行關聯性分析的冗余分析結果中射線較長，與菌糠青貯發酵關系較大的是菌屬為片球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬。高通量測序結果中，玉米秸稈綠汁發酵、葛藤綠汁發酵液、紅象草綠汁發酵液、菌糠綠汁發酵液和甘蔗梢綠汁發酵液中相關的菌株占得比例為32.56%(明串珠菌屬29.81%和乳球菌屬2.75%)、9.18%(明串珠菌屬6.97%和魏斯氏菌屬2.21%)、38.29%(乳球菌屬28.12%和明串珠菌屬10.17%)、6.09%(明串珠菌屬6.09%)和15.58%(明串珠菌屬9.43%、乳球菌屬3.44%和魏斯氏菌屬2.71%)，這個結果中紅象草綠汁發酵液中與青貯有關的乳酸菌屬占的比例最高，在紅象草綠汁發酵液液中占據了絕對優勢的比例，這應該是其在6個處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳的主要原因。綠汁發酵液中含有許多有其他菌屬的細菌，其中歐文氏菌屬為兼性好氣菌，代謝為呼吸型或發酵型，pH值5.3～9.2均可生長，最適pH值 7.2；克雷白氏菌屬為兼氣性厭氧菌，若pH值低于6.0或高于8.0則生長緩慢；沙門氏菌，為兼性厭氧，最佳pH值為6.5～7.5；沙雷氏菌屬為兼性厭氧，幾乎所有的菌株能在pH 5～9下生長[27]。這些菌株均為兼性厭氧，在發酵初期會與青貯相關的乳酸菌進行競爭，只有當青貯料的pH降到5.0以下時，其生長才被抑制，因此，這些菌占比例較大時，其添加效果就不穩定，具體體現在玉米秸稈綠汁發酵液中，其與青貯有關的乳酸菌占32.56%的比例，但僅克雷白氏桿菌屬占31.96%，因此無法突出乳酸菌優勢菌群的效果。而假單胞菌屬，這些菌專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞、有莢膜桿菌，不發酵糖類，pH值低于5.0或高于9.0則基本不生長[27]，因此其對青貯發酵影響不大，并且這些菌屬許多為專性需氧菌，在厭氧條件下其生長被抑制[28]，而與青貯相關的乳酸菌為厭氧菌，在厭氧的條件的，能夠迅速生長繁殖，迅速提高其在發酵料中的的比例，正面影響青貯發酵進程。這可能就是葛藤綠汁發酵液中，雖然假單胞菌屬占最高比例，是葛藤綠汁發酵液的優勢菌，但葛藤綠汁發酵液的添加效果卻僅次于紅象草綠汁發酵液的原因。近年來，一些報道表示綠汁發酵液的使用存在不穩定，通過本試驗結果可表明，其主要原因是其中與青貯相關的乳酸菌屬所占比例較低，其他兼性厭氧菌屬占比例較高造成的。冗余分析的結果也證明，正是這些菌屬的不同，造成青貯品質的差異。本試驗中，在綠汁發酵液中，嗜酸球菌、干酪腸球菌、細辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌和格氏乳球菌等菌株與青貯料的pH值和氨態氮有密切的相關性，這些菌株在乳酸菌商品添加劑中較為常用的菌株，已經有較肯定的效果，然而腸系膜明串珠菌和無乳鏈球菌與對青貯發酵產物中的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的產生有較大的相關性，目前對這兩株菌在青貯的的應用研究較少報道，需進一步深入研究。

4 結論

5種綠汁發酵液均能夠顯著提高青貯料的乳酸含量，顯著降低青貯料的丁酸含量，提高菌糠青貯料的發酵品質。不同原料制備的綠汁發酵中微生物種群分布有明顯差異，在青貯發酵中，效果不完全不同。本試驗五種綠汁發酵液中，紅象草綠汁發酵液與青貯相關的乳酸菌比例最高，在6個處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳。通過Miseq高通量測序技術分析，能夠清楚的解析綠汁發酵液中微生物的分布情況，闡明綠汁發酵液中微生物的分布與青貯料品質的關系。