氮沉降對貝加爾針茅草原土壤真菌群落結構的影響

劉紅梅, 張海芳, 秦 潔, 楊殿林

(農業農村部環境保護科研監測所， 農業農村部產地環境污染防控重點實驗室/天津市農業環境與 農產品安全重點實驗室， 天津 30019)

自工業革命以來，由于工農業生產、化肥的使用及畜牧業的發展等向大氣中排放的含氮化合物劇增，大氣氮沉降成比例增加，帶來一系列的生態環境問題，如土壤酸化[1]、營養失衡、植物多樣性降低[2]等，影響了陸地生態系統的結構和功能。氮沉降對陸地生態環境的影響已成為國內外生態和環境研究的熱點問題之一。

土壤微生物是土壤生態系統變化的敏感指標，用來指示土壤質量變化。氮素是大多數陸地生態系統的重要限制因素[3]，氮沉降增加可以通過影響土壤化學性質變化[4]，引起土壤微生物活性[5]、土壤微生物群落結構改變，也可以通過影響地上植物的生長間接影響土壤微生物群落結構[6]。真菌作為土壤微生物中的重要組成部分，在土壤生態中具有不可忽視的地位[7]，與土傳病害、植物互作、分解有機物質等密不可分[8-9]，因此研究氮沉降對土壤真菌的影響具有重要意義。之前研究表明施入氮肥會降低真菌的生物量，降低多樣性和改變真菌的組成結構[10]，增加病原菌豐度[11]；長期施氮導致東北黑土由健康易于保持平衡的“細菌型”向易發生土傳病害的“真菌型”轉變[12]。

貝加爾針茅草原是我國北方溫帶草原，氮素是該系統生長發育的限制因子。有研究表明，該溫帶草原每年氮沉降量高達3.43 g·m-2，并且在未來仍將持續增加[13]。本文通過模擬氮沉降增加，應用Illumina Miseq高通量測序技術，研究不同氮沉降水平下貝加爾針茅草原土壤真菌群落結構的變化特征，及其與土壤理化性質的偶聯關系，為深入研究氮沉降增加對草原土壤生態系統影響提供參考。

在我國有很多校企合作培養應用型人才的模式，即學生在學校學習專業知識，在暑期或者大三以后到企業進行實踐聯系，將自己在學校學習到的專業知識應用到工作中，這樣學習-生產-實踐的模式能夠使學生熟練的掌握專業知識，積累工作經驗，為以后的工作打下堅實的基礎。總之，高校在進行小語種人才培養時，應該注重與企業的合作，不斷提高學生的綜合素質。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區域概況、試驗地主要植物、試驗開始前土壤理化性質及試驗設計詳見參考文獻[5]。試驗樣地在內蒙古貝加爾針茅草原的典型地帶(119°41′ E，48°35′ N)。海拔平均高度為760 m，半干旱大陸性季風氣候，年降水量328.7 mm，年均氣溫-1.6 ℃，土壤類型為暗栗鈣土。植被類型主要為貝加爾針茅(Stipabaicalensis)和羊草(Leymuschinensis)。選擇植被典型、地勢平坦地段設置模擬氮沉降試驗，四周用圍欄保護。于2010年6月開始模擬氮沉降試驗，氮處理設8個水平，對照N0，低氮沉降(15，30，50 kg N·hm-2·a-1)分別記為N15，N30和N50，高氮沉降(100，150，200，300 kg N·hm-2·a-1)分別記為N100，N150，N200和N300。氮添加于每年6月中旬和7月中旬分兩次施入，氮肥為NH4NO3。4次重復，小區面積8 m×8 m，小區間設2 m隔離帶，重復間設5 m隔離帶。

不同氮沉降處理下土壤真菌屬水平組成分析(表3)。0～10 cm土層，8個處理之間優勢菌屬Archaeorhizomyces的相對豐度存在顯著性差異，N15，N30處理顯著高于對照(P<0.05)，而N50、N100、N150，N200和N300則低于或顯著低于對照；N15，N30，N50處理Fusarium相對豐度與對照無顯著差異，N100、N150、N200和N300處理則顯著高于對照(P<0.05)；N50和N100處理Arnium相對豐度顯著高于對照(P<0.05)，N15、N30與對照相比無顯著差異，N150，N200，N300顯著低于對照(P<0.05)；N50，N100，N150，N200處理的Paramicrothyrium相對豐度顯著高于對照(P<0.05)，N15，N30，N300處理與對照無顯著差異。10～20 cm土層，除N50處理外，其他氮沉降處理Archaeorhizomyces的相對豐度均顯著低于對照(P<0.05)；N15，N30，N50和N200處理的Fusarium相對豐度與對照無顯著差異，N100和N300處理則顯著高于對照(P<0.05)；N15，N30，N50，N100和N150處理Arnium相對豐度高于或顯著高于對照，N200和N300處理則低于或顯著低于對照；氮沉降提高了10～20 cm土層Paramicrothyrium相對豐度。氮沉降處理顯著降低了兩個土層Entoloma屬相對豐度。同一氮沉降處理，不同土層5種優勢菌屬總體上差異明顯，表明5種優勢菌屬在兩個土層中存在著土層梯度效應。

1.2 樣品采集

CCA分析主要反映樣品、菌群與環境因子之間關系。分別對不同氮沉降處理不同土層優勢真菌門與土壤化學因子進行CCA分析。0～10 cm土層真菌群落結構CCA分析結果顯示(圖2，A)，前兩軸可解釋群落結構變化的86.3%。土壤pH(P=0.002)、硝態氮含量(P=0.002)、有機碳(P=0.006)、速效磷含量(P=0.004)和全磷含量(P=0.01)與土壤真菌群落組成顯著相關。10～20 cm土層真菌群落結構CCA分析結果顯示(圖2，B)，前兩軸可解釋群落結構變化的93.0%。土壤pH(P=0.002)、有機碳(P=0.006)、硝態氮含量(P=0.008)、銨態氮含量(P=0.002)和速效磷含量(P=0.038)與土壤真菌群落組成顯著相關。綜合分析認為，影響土壤真菌群落結構主要因素是pH、硝態氮、有機碳和速效磷。

1.3 測定方法

Sordariomycetes相對豐度在兩個土層中，均以N50處理最高，顯著高于其他氮沉降處理。氮沉降提高了10～20 cm土層Dothideomycetes相對豐度，顯著降低了兩個土層Agariomycetes相對豐度。高氮沉降(N100、N150、N200和N300)處理顯著降低了兩個土層Archaeorhizomycetes相對豐度。高氮沉降(N150、N200、N300)處理顯著降低了兩個土層Eurotiomycetes相對豐度。高氮沉降(N100、N150、N200、N300)處理提高了0～10 cm土層Incertae相對豐度，降低了10～20 cm土層Incertae相對豐度。同一氮沉降處理，不同土層6種優勢菌綱總體上差異明顯，表明6種優勢菌綱在兩個土層中存在著土層梯度效應。

土壤DNA提取和ITS區高通量測序：使用美國MOBIO公司的PowerSoil?DNA Isolationkit試劑盒提取土壤總DNA，依據試劑盒說明書方法提取。提取后的土壤總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用NanoDrop(2000)超微量分光光度計進行質檢。為了使土壤總DNA具有重復性和代表性，每個處理的每個重復樣品，提取3次DNA，分別進行擴增，混合均勻后送至北京奧維森基因科技有限公司，應用Illumina MiSeq平臺進行測序。擴增引物為ITS1F/ITS2 (ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。Illumina Miseq平臺測序的主要步驟：按指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物，使用Qubit熒光定量系統對PCR產物進行定量檢測。依據每個樣本的測序量要求以及定量結果進行相應比例的混合。然后將含有標簽的接頭與DNA片段鏈接。選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，擴增DNA文庫，使用測序平臺對真菌ITS區進行測序。

1.4 數據統計與分析

另外，陽泉市大部分地表水污染相當嚴重，如桃河、溫河水，水質類別為Ⅴ類，乃至劣Ⅴ類水，加之河流底泥污染嚴重，污染的河水通過以上廢棄污染井的入滲污染下部地下水。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質變化

選取兩個土層相對豐度均大于1%的6個綱進行方差分析(表2)。0～10 cm土層，糞殼菌綱Sordariomycetes(相對豐度10.27%～20.02%)，傘菌綱Agariomycetes(相對豐度5.56%～15.78%)，谷菌根菌綱Archaeorhizomycetes(相對豐度3.13%～11.44%)，散囊菌綱Eurotiomycetes(相對豐度2.52%～5.29%)，座囊菌綱Dothideomycetes(相對豐度1.44%～4.46%)，絲足蟲綱Incertae(相對豐度1.07%～2.33%)。10～20 cm土層，糞殼菌綱Sordariomycetes(相對豐度13.95%～22.64%)，座囊菌綱Dothideomycetes(相對豐度8.44%～13.73%)，傘菌綱Agariomycetes(相對豐度4.15%～9.01%)，散囊菌綱Eurotiomycetes(相對豐度1.84%～4.25%)，谷菌根菌綱Archaeorhizomycetes(相對豐度0.68%～3.60%)，絲足蟲綱Incertae(相對豐度0.89%～1.53%)。

2.2 土壤真菌優勢門的相對豐度變化

不同氮沉降處理的土壤中檢測到7個真菌門，優勢真菌有5個。0～10 cm土層，子囊菌門Ascomycota (相對豐度26.80%～39.98%)，擔子菌門Basidiomycota(5.57%～15.84%)，接合菌門Zygomycota (1.47%～3.01%)，球囊菌門Glomeromycota (0.10%～3.47%)，壺菌門Chytridiomycota (0.05%～0.73%)(見圖1)。隨著氮沉降水平的提高，子囊菌門相對豐度呈先升高后降低的趨勢，在N50處理時最高。氮沉降處理的Basidiomycota與Glomeromycota均顯著低于對照N0(P<0.05)。N15的Zygomycota略低于對照N0，但無顯著差異，其他氮沉降處理的Zygomycota均顯著高于對照N0(P<0.05)。N150、N200和N300的Chytridiomycota顯著高于對照N0(P<0.05)，而N15、N30、N50、N100的低于或顯著低于對照N0。10～20 cm土層，子囊菌門Ascomycota (相對豐度35.80%～55.14%)，擔子菌門Basidiomycota(4.31%～9.17%)，接合菌門Zygomycota (1.19%～1.91%)，球囊菌門Glomeromycota (0.29%～1.19%)，壺菌門Chytridiomycota (0.03%～0.09%)(圖1)。N0處理Ascomycota的相對豐度為42.99%，N30處理、N50和N200處理分別提高到44.51%、55.14%和46.28%，N50處理最高，而N15、N100、N150和N300處理均顯著低于對照N0(P<0.05)。氮沉降處理的Basidiomycota均顯著低于對照N0(P<0.05)。N200、N300的Zygomycota低于對照N0，但無顯著差異，其他氮沉降處理的Zygomycota均顯著低于對照N0(P<0.05)。N100、N300的Glomeromycota與對照無顯著差異，N15、N30、N50、N150、N200的Glomeromycota顯著高于對照N0(P<0.05)。N150、N200和N300的Chytridiomycota高于或顯著高于對照N0，而N15、N30、N50、N100的低于或顯著低于對照N0。可見連續6年氮沉降引起了兩個土層真菌優勢菌門相對豐度的差異，且表現出了土層之間的差異。

表1 不同氮沉降水平下土壤化學性質的變化Table 1 Soil chemical properties in different nitrogen deposition treatments

注：同列不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)

Note:Different letters within the same column indicate significant difference among treatments at the 0.05 level

圖1 不同氮沉降處理土壤真菌門類相對豐度變化Fig.1 Relative abundances of the dominant fungal phylum under different nitrogen deposition treatments

連續6年不同氮沉降水平下，土壤化學性質變化見表1。0～10 cm土層，7種氮沉降處理土壤pH值均低于對照N0。10～20 cm土層，高氮沉降處理(N100，N150，N200和N300)pH值顯著低于對照N0(P<0.05)，低氮沉降處理(N15，N30和N50)pH值與對照無顯著差異。0～10 cm土層與10～20 cm土層，高氮沉降處理(N100，N150，N200和N300)有機碳、硝態氮、銨態氮和速效磷含量均高于或顯著高于對照N0。

土壤化學性質測定：土壤總有機碳測定采用重鉻酸鉀外加熱法，土壤全氮用凱氏定氮法，土壤全磷采用鉬銻抗比色法，土壤pH采用玻璃電極法(土水質量比1:2.5)，土壤銨態氮和硝態氮含量采用氯化鉀溶液提取-流動分析儀(QC8000)測定，土壤速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法[14]。

通過Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，使用Trimmomatic軟件修剪數據末端堿基，以Q20≥90的標準用Readfq(vertion 6.0)軟件將低質量的成對reads過濾掉；利用FLASH (version 1.2.10)軟件把成對的reads通過其overlap拼接到一條序列，拼接的錯誤匹配率為0.1。利用Mothur軟件去除長度小于200bp的序列和maxhomop大于10的序列，并去除嵌合體。在0.97相似度下利用QIIME(v1.8.0)軟件將拼接過濾后的序列聚類為用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)，統計各個樣品每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，對OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平統計每個樣品的群落組成。采用SPSS16.0軟件進行單因素ANOVA分析，并用Turkey顯著差異法分析處理間的差異顯著性。采用CANOCO5.0將土壤化學性質和真菌群落組成進行典范對應分析(CCA)。

總之，目前學界對于馬克思共產主義思想的理解更多地生成于對于文本的解讀和其時代精神的詮釋，思想理論的祛魅化闡釋成效顯著，已有成果較為全面地展現出馬克思這一思想的本真性內涵和精神本質，為人們深入研究馬克思哲學超越維度奠定了堅實的理論基礎。

2.3 土壤真菌優勢屬的相對豐度變化

以上這些對人的能力、潛力的平等主義、樂觀主義的思想，是增能理論的核心的理論基礎，增能理論就是把每個人的內在力量、內在資源作為自己的核心理論基石。

表2 不同氮沉降處理的土壤真菌綱相對豐度Table 2 Relative abundances of fungal common class under different nitrogen treatments/%

注：表中列出的真菌均為8個處理中至少有一個處理的相對豐度> 1%；同行不同小寫字母表示處理間差異顯著，同列不同大寫字母表示同一氮沉降水平土層之間差異顯著。下同

Note：The relative abundance of the fungi listed in the
Table is higher than 1% at one of the eight treatments at least；Different small letters within the same line indicate significant difference among treatments at the 0.05 level,different capital letters within the same column indicate significant difference between the horizontal soil layers of the same nitrogen treatment at the 0.05 level. The same as below

表3 不同氮沉降處理的土壤真菌屬相對豐度Table 3 Relative abundances of fungal common genera under different nitrogen treatments/%

2.4 典范對應(CCA)分析

于2015年8月中旬，在各個不同處理小區內按照S型取樣法選取10個點，去除表面植被，取0～10 cm，10～20 cm土層土壤各自分別混勻。去除根系和土壤入侵物，將其分成兩份，一份迅速裝入無菌封口袋，放在冰盒中帶回實驗室，放入-20℃低溫保存，用于測定土壤微生物群落分析，另一份土樣室內自然風干用于土壤理化性質測定(用鮮土測定土壤銨態氮、硝態氮和速效磷含量)。

圖2 優勢真菌門(A,0～10 cm土層；B,10～20 cm土層)與土壤化學因子CCA分析Fig.2 Canonical correspondence analysis (CCA) on soil dominant fungal phyla and soil chemical properties (A,0～10 cm soil layer;B,10～20 cm soil layer)注：○N0，×N15，△N30，▽N50，□N100，+N150，◇N200，☆N300Note:○N0,×N15,△N30,▽N50,□N100,+N150,◇N200,☆N300

3 討論

大量研究表明，氮肥降低真菌生物量[15]，降低真菌多樣性，改變土壤中真菌的組成結構[10,16]。本研究通過門、綱和屬三個水平的相對豐度分析可知，不同氮沉降水平明顯改變了貝加爾針茅草原土壤真菌群落結構和豐度，且在0～10 cm土層和10～20 cm土層土壤中表現出不同的響應模式。已有研究結果表明，土壤真菌組成與土壤剖面層次、施肥量有關[17]。Chen等[6]研究認為，Ascomycota是中國北方干旱和半干旱草原主要優勢真菌。本研究中，Ascomycota是貝加爾針茅草原土壤的優勢類群。這與其研究一致。klaubauf等[18]研究表明，氮肥能夠促進優勢真菌類群的生長。Wang等[19]研究表明，氮素過高對Ascomycota類的真菌生長有害。Edwards等[20]研究表明，氮沉降提高會顯著降低Ascomycota相對豐度。本研究中，0～10 cm土層，高氮沉降處理(N100、N150、N200和N300)Ascomycota顯著低于對照N0，表明這類真菌對高氮環境較為敏感。Ascomycota類真菌的豐度的降低反過來會影響土壤中碳的降解。本研究中，氮沉降處理均顯著降低了兩個土層的擔子菌門Basidiomycota的相對豐度，尤其是Agariomycetes綱的相對豐度。這是因為Agariomycetes多數屬于叢枝菌根且多為腐生菌，能分泌過氧化物酶從而促進土壤中木質素、作物殘留物的分解[21]。劉星等[22]研究發現，氮沉降降低了土壤過氧化物酶活性。推測是由于連續氮沉降降低了Agariomycetes對養分和能源的競爭力，導致其生長緩慢。Dothideomycetes綱對細胞壁的降解有重要貢獻[23]，對于植物的降解和全球碳循環有重要作用，本研究中10～20 cm土層中所有氮沉降處理中該類真菌都升高，這表明氮沉降提高了10～20 cm土層土壤微生物對土壤中凋落物分解的貢獻。Fusarium屬是反硝化功能的重要菌屬，其功能是進行反硝化，從而減少土壤中氮素含量。本研究中，氮沉降提高了0～10 cm土層Fusarium屬的相對豐度，雖然Fusarium物種豐度的增加并不一定意味著反硝化速率的增加，但也是一個重要影響因素。Ochoa-Hueso等研究發現，氮沉降改變了土壤碳氮的存儲能力、凈氮礦化能力[24]。

本研究通過土壤化學性質與真菌組成的CCA分析，可以知道土壤化學性質影響著貝加爾針茅草原土壤真菌群落結構。土壤pH為陸地生態系統中土壤真菌群落變化的關鍵因子[25]，這可能與土壤養分物質存在的形式有關系。土壤真菌以土壤有機質為養分和能源，因此，土壤有機碳的變化，對土壤真菌的影響較大。Liu等(2015)研究證明，土壤有機碳含量決定了東北地區真菌群落的地理分布[26]。本研究中，高氮沉降顯著增加了土壤有機碳含量[5]，其原因可能是氮沉降促進了地上植被的生長，生物量增加[27]，從而使得進入土壤的植物殘體和根系分泌物增加。典范對應分析也表明，土壤pH值、土壤有機碳、硝態氮含量與土壤真菌群落結構顯著相關，表明土壤真菌群落參與了土壤碳氮循環。進一步研究可通過同位素示蹤等方法，明確真菌在貝加爾針茅草原土壤有機質分解與氮素轉化中的過程和作用機制，對貝加爾針茅草原生態系統健康及可持續發展至關重要。

4 結論

連續6年模擬氮沉降下，貝加爾針茅草原真菌優勢菌相對豐度發生改變，這種改變在真菌門、綱和屬分類水平上均有體現，且存在明顯的土層梯度效應。

在進行農業技術推廣的過程中，農業技術推廣站起著重要的作用。因此，為了促進農村地區的發展必須重視農業技術的推廣，應該加大對經費的投入力度，不斷提升農業技術人員的專業技能和水平。只有這樣，農業技術推廣站才能將科技成果向著生產力轉變，進而實現農業的發展，農民收入的提升，最終實現鄉村的振興。

連續6年氮沉降下，顯著改變了土壤理化因子，這些環境因子的變化進一步影響了土壤真菌群落結構，其中pH、硝態氮、有機碳和速效磷是影響土壤真菌群落結構變化主要影響因子。