藜麥黃酒發酵工藝優化及抗氧化特性研究

張文剛 張 杰 黨 斌 楊希娟

(1.青海大學農林科學院，青海 西寧 810016；2.青海省農林科學院青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海 西寧 810016；3.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)為藜科藜屬一年生雙子葉植物，原產于南美安第斯地區，由于其性質特征與小麥、水稻等常見谷物類似而被稱為“假谷物”，它是目前聯合國糧食及農業組織(FAO)認為唯一能滿足人體基本營養需求的“全營養食品”[1]。藜麥蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質等顯著高于一般谷物，同時富含多酚、黃酮、皂苷、多糖等活性成分，表現出良好的抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓、降血糖等功效，被國際營養學家稱為“營養黃金”“未來食品”等[2-3]。目前，藜麥在中國山西、陜西、青海、四川、浙江等地區均有種植，作為一種“健康食品”原料具有廣闊的開發前景[4]。

黃酒在中國釀造歷史悠久，制作原料主要以稻米、黍米、小米、玉米等為主，其含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素，還含有多種有機酸、酯類物質及礦物質，兼具良好的食用和藥用價值[5-7]，對避免當下精加工食品功能營養缺乏、防治慢性代謝疾病、改善腸道菌群、降低膽固醇等有積極意義[8]。傳統黃酒釀造工藝周期長、原料利用率低、勞動投入大，近年來廣泛使用的液化法釀造新工藝以微生物和酶制劑的液化、糖化和發酵為基礎，具有適用性廣、效率高、醪液流動性可控、易機械化等優點，在多種雜糧黃酒的釀制中已有應用[9-10]。劉浩等[11]以炒制燕麥為原料，利用液化法制作燕麥黃酒，優化工藝后可得到口味醇爽、品質符合國標的黃酒產品；楊祖滔等[12]研究顯示，在最佳條件下薏米糯米黃酒香味清幽、口感醇和、色澤鮮亮。黃酒發酵過程中原料多酚和黃酮溶出，單寧轉化為小分子酚類，蛋白質部分分解為活性多肽和氨基酸，這些物質是其發揮清除自由基、抑制腫瘤、調節細胞代謝、抗菌消炎等多種生理功效的重要物質基礎[13-14]。藜麥具有“全營養”特征，具有發展不同類型功能黃酒的良好前景。目前，藜麥黃酒研究尚處初始階段，對其加工技術及功能性分析還需深入探討。

試驗擬以藜麥為原料，采用液化法發酵藜麥黃酒，對液化、糖化及主發酵條件進行優化，在此基礎上探討發酵過程中酒體抗氧化特性，以期為藜麥黃酒等發酵產品的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青藜2號：青海省農林科學院作物所；

耐高溫α-淀粉酶(4.0×104U/g)、糖化酶(1.0×105U/g)：食品級，江蘇瑞陽生物科技有限公司；

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

葡萄糖、福林酚、酪蛋白磷酸肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

3,5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚、過硫酸鉀、硫片：分析純，南京化學試劑有限公司；

甲醇、無水乙醇、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、三氯乙酸(TCA)、硫酸銅：分析純，天津市津北精細化工有限公司；

試驗中使用的水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：N4S型，上海儀電分析儀器公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)公司；

生化培養箱：LRH-150型，上海齊欣科學儀器公司；

高速中藥粉碎機：FW200型，天津華鑫儀器廠；

電熱鼓風干燥箱：101A-2ET型，上海試驗儀器廠有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DKB-600B型，上海一恒科學儀器有限公司；

離心機：Centrigue 5430R型，德國艾本德公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥預處理 藜麥除雜清洗后45 ℃烘干，磨粉過60目篩，取藜麥粉適量按一定料液比95 ℃糊化10 min。

1.3.2 還原糖含量測定 采用DNS法[12]。葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)梯度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0 mL，實際樣品3 000 r/min離心后取上清液測定，根據標準曲線定量。

1.3.3 酒精含量測定 采用比重法[15]。

1.3.4 藜麥液化、糖化條件優化 以還原糖含量為指標，通過單因素和L9(33)正交試驗優化藜麥液化、糖化條件。液化探討因素包括液化時間(10，20，30，40，50，60 min)、耐高溫α-淀粉酶添加量(3，4，5，6，8，10 U/g)、液化溫度(80，85，90，95，100 ℃)；糖化探討因素包括糖化時間(30，60，90，120，150，180，210，240 min)、加酶量(50，60，70，80，90，100，110 U/g)、糖化溫度(40，45，50，55，60，65，70，75 ℃)。液化單因素試驗固定條件：液化時間40 min、耐高溫α-淀粉酶添加量5 U/g、液化溫度95 ℃、料水比1.0∶3.5(g/mL)；糖化單因素試驗固定條件：糖化時間90 min、糖化酶添加量80 U/g、糖化溫度60 ℃。

1.3.5 藜麥黃酒主發酵條件優化 以酒精含量為指標，通過單因素和L9(33)正交試驗優化藜麥黃酒主發酵條件。探討因素包括料水比[1.0∶2.5，1.0∶3.0，1.0∶3.5，1.0∶4.0，1.0∶4.5，1.0∶5.0(g/mL)]、酵母接種量(3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%)、發酵溫度(24，26，28，30，32，34，36 ℃)。在優化參數下發酵藜麥黃酒，持續發酵8 d，連續監測總酚、總黃酮、多肽含量及抗氧化性。主發酵單因素試驗固定條件：料水比1.0∶3.5(g/mL)、酵母接種量4.0%、發酵溫度28 ℃。

1.3.6 總酚、總黃酮含量測定 參照Adom等[16]的方法，結果分別以沒食子酸當量(μmol/100 g·DW)和Trolox當量(μmol/100 g·DW)表示。

1.3.7 多肽含量測定 參照康樹杰等[17]的方法。酪蛋白磷酸肽濃度梯度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL(5% TCA)，樣品以等體積10% TCA沉蛋白后，4 000 r/min離心15 min，取上清定容后，540 nm處測定OD值，按式(1)計算多肽的質量濃度。

C1=C0×50/2.5×100%，

(1)

式中：

C1——樣品多肽的質量濃度，g/L；

C0——標準曲線中的多肽濃度，g/L。

1.3.8 抗氧化指標測定

(1)DPPH自由基清除能力：參照文獻[18]。

(2)ABTS+自由基清除能力：參照文獻[19]。

(3)FRAP鐵還原力：參照文獻[20]。

1.3.9 數據處理 采用Minitab 15軟件及Excel進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 藜麥液化工藝優化

根據單因素試驗結果選擇適宜參數水平(見表1)，以還原糖含量為指標設計正交試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

由表2、3可知，各因素對藜麥液化程度的影響主次順序為高溫α-淀粉酶添加量>液化溫度>液化時間，最佳條件組合為A3B3C2，即液化時間50 min、酶添加量6 U/g、液化溫度95 ℃；酶添加量和液化溫度對液化物還原糖含量均有顯著影響(P<0.05)，液化時間影響不顯著；與劉浩等[11]研究結果基本一致。

表1 藜麥液化正交試驗因素水平表

表2 藜麥液化正交試驗結果

表3 藜麥液化正交試驗方差分析表?

2.2 藜麥糖化工藝優化

根據單因素試驗結果選擇適宜參數水平(見表4)，以還原糖含量為指標設計正交試驗，試驗結果見表5，方差分析見表6。

表4 藜麥糖化正交試驗因素水平表

表5 藜麥糖化正交試驗結果

表6 藜麥糖化正交試驗方差分析表?

由表5、6可知，各因素對藜麥糖化程度的影響主次順序為糖化溫度>糖化酶添加量>糖化時間，最佳條件組合為A3B3C2，即糖化溫度70 ℃、糖化酶添加量100 U/g、糖化時間150 min，與劉浩等[11]研究結果一致；3個糖化影響因素對還原糖含量的影響均達到顯著水平(P<0.05)。

2.3 藜麥主發酵工藝優化

根據單因素試驗結果選擇適宜參數水平(見表7)，以酒精度為指標進行正交試驗，試驗結果見表8，方差分析見表9。

由表8、9可知，各因素對醪液主發酵影響最大的為料水比，其次為酵母接種量，發酵溫度影響相對較小；最優條件為A2B2C2，即料水比1∶4(g/mL)、酵母接種量4.0%、發酵溫度30 ℃；料水比和酵母接種量對酒精度影響顯著(P<0.05)。

2.4 發酵過程中黃酒活性成分及抗氧化活性的變化

2.4.1 總酚、總黃酮含量 由圖1可知，總酚、總黃酮含量在整個發酵過程中均先增大后減小，在發酵6 d后又出現緩慢增加趨勢。發酵前5 d，隨著酵母繁殖和代謝作用的增強，發酵液酒精含量逐漸提高，使得總酚、總黃酮不斷被浸提出[21]，同時在酵母作用下物料部分結合酚類被溶出，使得酚類化合物總量逐漸升高；發酵5～6 d時，酚類化合物明顯降低，可能與單體酚聚合及酚類物質氧化等作用有關[22]；發酵6 d后，發酵體系中糖分減少使得發酵放緩，但隨發酵時間的延長料液酒精度增加緩慢，部分結合酚釋放及酚類繼續溶出，使得酚類化合物含量再次增加。

表7 藜麥主發酵正交試驗因素水平表

表8 藜麥主發酵正交試驗結果

表9 藜麥主發酵正交試驗方差分析表?

圖1 藜麥糖化物發酵過程中總酚、總黃酮的變化

Figure 1 Changes in total polyphenol and total flavonoid contents during the fermentation of quinoa saccharide

2.4.2 多肽含量 由圖2可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中多肽含量先升高后降低，發酵第4天，多肽含量達到最大值4.95 g/L；發酵7 d后多肽含量趨于穩定，保持在3.20 g/L左右。藜麥發酵過程中多肽主要來源于兩個方面：① 微生物自溶；② 原料中的蛋白質分解。在發酵初期酵母大量繁殖并不斷自溶，細胞中多肽釋放進入發酵液中，同時蛋白質較多降解形成多肽；而在發酵后期微生物生長繁殖能力下降且蛋白質含量減少，多肽的形成與分解相對平衡，發酵液中多肽含量變化趨于穩定。

圖2 藜麥糖化物發酵過程中多肽含量的變化

2.4.3 抗氧化性 由圖3可知，DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力及鐵還原力在發酵過程中總體呈先增大后減小趨勢。DPPH自由基清除能力在發酵第3天達最大值，之后快速降低，第4～8天變化緩慢；ABTS+自由基清除能力在發酵第4天達最高，第4～6天快速降低，而第6～8天出現波動；FRAP還原力在發酵初始(1～3 d)保持在較高水平，延長發酵時間，還原力逐漸下降，第8天保持在12.86 μmol/100 g·DW。藜麥發酵液中抗氧化性的變化可能與其活性物質含量和組成相關，總酚可能對FRAP鐵還原力和DPPH自由基清除力影響較大，而總黃酮、多肽可能對ABTS+自由基清除能力影響較大。

圖3 藜麥糖化物發酵過程中抗氧化活性的變化

3 結論

(1)藜麥黃酒的最佳液化、糖化及主發酵工藝條件為：耐高溫α-淀粉酶添加量6 U/g，液化溫度95 ℃，液化時間50 min；糖化酶添加量100 U/g、糖化溫度70 ℃、糖化時間150 min；料水比1∶4(g/mL)、酵母添加量4.0%、發酵溫度30 ℃。

(2)藜麥黃酒含有較多活性物質且隨發酵時間呈動態變化，其中黃酒總酚、總黃酮在主發酵第5天達到峰值，后發酵階段仍能保持較高水平；多肽含量發酵第4天達到4.95 g/L，發酵后期保持在3.20 g/L，發酵過程是酒體特征及活性物質形成的關鍵時期。

(3)藜麥黃酒清除DPPH、ABTS+自由基能力及FRAP鐵還原力呈先升高后降低趨勢，發酵第3天總體抗氧化性最強，發酵后期仍保持一定抗氧化活性；發酵液的體外抗氧化特征可能與其活性物質的形成及變化有關。

(4)試驗中酵母添加量大，但發酵較緩慢，發酵物酒精度偏低，主要由于藜麥經液化糖化后還原糖含量低；后續可從醪液糖度調控、酵母選擇等方面優化，并結合抗氧化性特征，制作品質、功能性較優的藜麥黃酒產品。