仙靈脾改善小鼠睡眠功效成分的分離鑒定

侯云飛 徐德平

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

仙靈脾又名淫羊藿、千兩金、放杖草等，為小檗科淫羊藿屬多年生多種草本植物的根的統稱，被衛生部確定可用于保健食品的原料，首載于《神農本草經》，具有延緩衰老[1]、增強記憶[2]、激素及免疫調節[3]等功效。目前國內外對仙靈脾的報道很多，主要集中在抗疲勞方面[4]，但嚴金玲等[5]研究表明仙靈脾水提物具有中樞神經系統抑制作用，抑制小鼠自發活動，同時縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間。付立波等[6]利用腦立體定位技術進行仙靈脾總黃酮(TFE)的側腦室微量注射，通過多導睡眠描記術(PSG)對大鼠睡眠進行觀察，結果表明TFE可促進睡眠，一直覺醒，即TFE具有明顯的中樞抑制作用[7]。

現有的相關研究著重于仙靈脾的粗提取物上，有關仙靈脾助眠具體功效成分未見報道。試驗旨在運用色譜分離及小鼠睡眠[8]、自主活動[9]試驗，從仙靈脾中篩選出助眠的功能成分，為仙靈脾作為助眠藥物的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

仙靈脾：市售；

無水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸、正丁醇、二甲亞砜等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺芝罘化工廠；

AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學化學工廠；

中壓色譜分離凝膠(MCI GEL)填料：三菱化學公司；

C18色譜柱(ODS)填料：日本Tosoh公司；

雌雄ICR小鼠(體重18～22 g)：上海斯萊克動物實驗動物有限公司；

試驗用水為去離子水。

1.1.2 主要儀器設備

龍視安攝像頭：LS-Q130W-1型，廣東東莞市盛鼎電子科技有限公司；

磨粉機：GLF-205型，浙江省溫州市創立藥材器械廠；

萃取罐：RAT-100型，無錫申科儀器有限公司；

旋轉蒸發器：R-1002型，上海申順生物科技有限公司儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，江蘇省金壇市榮華儀器廠；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術公司；

暗室紫外投射儀：ZF-90型，上海顧順電光儀器廠；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，德國Bruker公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 仙靈脾提取物制備與粗分離 稱取仙靈脾10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(g/mL)料液質量體積比加入體積分數70%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取4 h，過濾，取濾液，濾渣按上述方法再次醇提，取濾液。合并兩次濾液，減壓濃縮至適宜體積，即為仙靈脾乙醇提取物，-20 ℃下冷凍保存。向仙靈脾醇提后的濾渣中按上述方法加100 L 去離子水，并于70 ℃條件下攪拌4 h，重復提取兩次，過濾，取濾液減壓濃縮至膏狀物，即為仙靈脾水提物。將仙靈脾醇提物和水提物合并，即為仙靈脾混合提取物。

取適量仙靈脾混合提取物上AB-8型大孔樹脂柱(10 cm×150 cm)[10]，依次用水和30%，50%，70%的乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤監測洗脫液中的成分，并根據TLC檢測結果將具有相同成分的洗脫液合并，將洗脫液分成A(水洗脫)、B(30%洗脫)、C(50%洗脫)和D(70%洗脫)4個部分。分別減壓濃縮后，-20 ℃下冷凍保存備用。

1.2.2 仙靈脾粗分物改善睡眠的作用 試驗100只SPF級ICR小鼠，雌雄兼用，體重為(18±4)g，許可證編號SYXK(蘇)2016-0045。適應性飼養1周后，隨機分為5組，每組20只。試驗組以1.0 g/kg·BW劑量分別一次性灌胃A、B、C、D，空白組灌胃同體積蒸餾水，連續灌胃14 d后，展開試驗。試驗在24～25 ℃安靜環境下進行。

(1)自主活動儀測試試驗：于末次給藥30 min后，將小鼠置于自主活動儀內，適應5 min后測定小鼠10 min內活動次數，自主活動記錄儀記錄小鼠活動次數及站立次數，作為評價小鼠活動情況的指標[11]。

(2)直接睡眠試驗：參照胡超群等[12]的方法進行直接睡眠試驗。自主活動試驗24 h后進行直接睡眠試驗[13]，于末次給藥30 min后觀察動物是否出現睡眠現象，記錄30 min內各組入睡動物數及12 h小鼠睡眠時間。

1.2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離 將含有改善睡眠功效的B組分上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用20%，30%，40%的乙醇進行梯度洗脫，流速8 mL/min，自動收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC法跟蹤檢測洗脫液中的成分[14]，根據Rf值和顯色反應的結果，分析合并相同組分，得到L(20%)、M(30%)和N(40%)3個組分。

1.2.4 MCI柱各洗脫組分改善睡眠活性的檢測 按1.2.2 方法對MCI柱分離得到的L、M、N進行動物試驗，分析各組分改善睡眠的作用。

1.2.5 改善睡眠活性成分的分離與鑒定 將具有改善睡眠活性的M組分反復上樣到ODS-D柱(3 cm×100 cm)、ODS-A柱(3 cm×100 cm)和 ODS-AQ 柱(3 cm×100 cm)，直至得到4個單體成分，用氘代二甲亞砜溶解進行1H NMR和13C NMR等光譜數據分析，確定其結構。

1.2.6 單體成分改善睡眠的功效 將4個單體成分按2.2 的方法進行動物試驗，判定4個單體成分的改善睡眠功效。

1.2.7 統計學處理 試驗結果以SPSS 24.0軟件進行統計學分析，試驗數據用(x±s)表示，采用One Way-ANOVA檢驗，直接睡眠試驗以入睡動物計數資料并經x2檢驗。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂粗分物改善睡眠活性分析

經灌胃14 d后，大孔樹脂粗分物各組小鼠睡眠率、睡眠時間及自主活動情況的測定結果見表1。由表1可知，各給藥組中，B組較空白組30 min入睡率有顯著提高(P<0.05)，睡眠時間明顯延長(P<0.05)，延長率達到17.38%；在自主活動方面，B組小鼠活動次數和站立次數顯著低于空白組(P<0.05)，其中雄鼠活動次數極顯著減少(P<0.01)。說明B(大孔樹脂30%乙醇洗脫組分)組具有改善睡眠的活性成分，并且該組分對雌雄鼠都具有一定的作用。因此，對大孔樹脂30%乙醇洗脫物進一步分離純化。

2.2 MCI柱各洗脫組分改善睡眠活性的檢測

大孔樹脂30%乙醇洗脫物MCI分離后的各組分改善睡眠功效見表2。以30 min內入睡動物為計數資料，結果經x2檢驗，只有M組與空白組有顯著性差異(P<0.05)。經One-Way ANOVA檢驗，發現僅M組較空白組睡眠時間增長，有極顯著性差異(P<0.01)。且M組與空白組活動次數及站立次數相比較，呈現顯著性差異(P<0.05)。其他各組較空白組均無顯著性差異(P>0.05)。雌雄鼠均無差異。故可判定仙靈脾改善睡眠功效成分主要存在于MCI柱層析30%乙醇洗脫物中。

2.3 單體成分的鑒定

MCI柱層析分離得到具有助眠活性的M組分，經進一步分離得到4個主要成分單體。成分Ⅰ為黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅱ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅲ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅳ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇。

表1 仙靈脾各組分對小鼠睡眠和活動情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

表2 仙靈脾各組分對小鼠睡眠和活動情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

由表3可知：

(1)成分Ⅰ：δ7.96，7.17各有2H，形成AA′BB′系統，表明含有苯環對位取代，δ6.68為單峰H，δ5.43，5.21，5.18為糖的端基H信號，說明成分含有3個糖基，δ3.90 為OMe，δ1.75、1.64，1.14，0.85共有4個甲基信號。成分Ⅰ共有38個碳信號，其中糖上18個碳信號，并有1個異戊烯基，余下15個碳信號，推測為黃酮類成分，參照文獻[15]鑒定為朝藿定C。

(2)成分Ⅱ：δ7.90，7.13各有2H，δ6.64 為單峰H，δ5.29，5.17，5.01為糖的端基H信號，說明成分含有3個糖基，δ3.86為OMe，δ1.69，1.61，0.81為3個。成分Ⅱ共有37個碳信號，其中糖上17個碳信號，并有1個異戊烯基，余下15個碳信號，推測為黃酮類，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是連接的糖鏈不同，含有1個木糖基，參照文獻[16]鑒定為朝藿定B。

(3)成分Ⅲ：δ7.91，7.14各有2H，δ6.64 為單峰H，δ5.18，5.02為糖的端基H信號，說明成分含有2個糖基，δ3.86 為OMe，δ1.69，1.62，0.82為3個甲基信號。成分Ⅲ共有32個碳信號，其中糖上12個碳信號，并有1個異戊烯基，余下15個碳信號，推測為黃酮類成分，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是只有2個糖基信號，參照文獻[17]鑒定為淫羊藿苷。

(4)成分Ⅳ：δ7.98，7.22各有2H，δ6.69為單峰H，δ5.07為糖的端基H信號，說明成分含有1個糖基，δ3.96為OMe，δ1.71，1.69為2個甲基信號。成分Ⅳ共有26個碳信號，其中糖上6個碳信號，并有1個異戊烯基，余下15個碳信號，應為黃酮類成分，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是只有1個糖基信號，參照文獻[18]鑒定為淫羊藿次苷。

朝藿定C的R基為Rha-Rha；朝藿定B的R基為Rha-Xyl；淫羊藿苷的R基為Rha；淫羊藿次苷R基為H

圖1 4種成分的化學結構

Figure 1 The chemical structures of compounds I，II，III and Ⅳ

表3 成分I、II、III、Ⅳ 的13C 核磁共振數據

2.4 對單體成分改善睡眠功效分析

從表4可以看出，與空白組相比，成分Ⅱ和Ⅳ在睡眠及自主活動指標方面均無顯著性差異(P>0.05)；成分Ⅰ雌雄鼠睡眠率提高了10%，雌雄鼠睡眠時間分別延長了117.3，136.9 min(P<0.01)，雌雄鼠活動次數分別減少88.9，88.8次(P<0.05)，雌鼠站立次數減少69.8次(P<0.05)，且雄鼠的站立次數極顯著減少95次(P<0.01)；成分Ⅲ雌雄鼠均可顯著提高入睡率，延長睡眠時間，抑制小鼠自主活動次數(P<0.05)。說明成分Ⅰ(朝藿定C)具有顯著改善睡眠作用，成分Ⅲ(淫羊藿苷)也有較好的作用。

表4 4種成分對小鼠睡眠和活動情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

近年來大量文獻[19-21]報道仙靈脾具有預防阿爾茨海黙癥和改善學習記憶的作用，這種改變與神經和中樞膽堿能系統有著密切的關系。同樣睡眠的變化與中樞神經是相關的，試驗結果反映出仙靈脾具有影響中樞神經功能，與付立波等[22]認為仙靈脾增加中樞的γ-氨基丁酸(GABA)含量或抑制GABA轉氨酶的活性，均可增加深睡眠和減少快速眼動睡眠研究結論相似。

3 結論

仙靈脾提取物大孔樹脂30%乙醇洗脫組分具有促進睡眠功能，該組分經MCI分離發現，改善睡眠功效成分集中在30%洗脫物中，對其進一步分離得到4個單體成分分別是朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、淫羊藿次苷，經直接睡眠試驗和自主活動測試明確成分朝藿定C和淫羊藿苷均可提高小鼠入睡率、延長睡眠時間及抑制自主活動次數，說明其具有改善睡眠的功效。

有關仙靈脾對神經系統的作用，大部分研究者[23-24]認為淫羊藿苷起主要作用，試驗發現改善睡眠的功能成分主要為朝藿定C，而不是淫羊藿苷。該化合物在體內可以通過增加中樞神經的γ-氨基丁酸(GABA)含量或是抑制GABA轉氨酶的活性產生作用，具體是哪種作用機制有待進一步研究。