朱敏方 張 露 葉云花 廖 卉

(1.江西師范大學國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌 330022；2.江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022)

豆豉是中國的傳統發酵豆制品，是大豆經過浸泡、蒸煮、攤涼、制曲、發酵等一系列工藝處理后制成的一種營養豐富、風味獨特的調味副食品。豆豉中含有多種有益成分如大豆多肽、大豆異黃酮、大豆低聚糖、大豆皂苷、類黑精類、豆豉溶栓酶等[1]。國內外研究發現豆豉具有抗氧化[2-3]、降血糖[4]、降血壓[5-7]、抗老年癡呆癥[8]等多種保健功能。

稻香園豆豉是通過“滬釀3.042米曲霉”發酵制得，其傳統發酵工藝中的洗曲僅洗掉了豆豉表面曲霉菌分生孢子和菌絲體，而基質菌絲可能繼續生長引起返霜。經前期預試驗模擬貨架期豆豉儲存條件(溫度約為20 ℃，相對濕度約為50%)，大約貯藏90 d時豆豉開始出現返霜；而通過恒溫恒濕培養箱(溫度37 ℃，相對濕度75%)進行加速返霜壽命試驗，第5天就開始出現明顯的返霜，且兩者最終返霜豆豉在感官評價上是一致的。返霜后豆豉色澤上，表面由褐色變成白色，出現霜狀顆粒；氣味上，出現不符合豆豉香氣的異味；黏度上，由外表微濕潤不粘手轉變為表面干燥或粘手。返霜極大地影響了外觀，也會使消費者對返霜豆豉的營養安全性產生質疑。曾小飛[9]對返霜后豆豉表面白色物質進行涂布培養，發現細菌為引起豆豉返霜的主要微生物，其次為酵母菌和霉菌。但目前未見關于豆豉在返霜過程中基本營養成分和返霜前后微生物多樣性差異的相關報道。

試驗擬以豆豉為研究對象，對貯藏0，3，6，9，12，15，18，21 d 的豆豉進行取樣測定水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、總糖、還原糖、總酸、氨基態氮含量，研究其基本成分變化規律；前期預試驗測得貯藏前3 d豆豉的氨基酸含量變化不大，綜合考慮選取貯藏0，6，15，21 d的豆豉進行氨基酸組成的測定，通過氨基酸評分對豆豉的蛋白質營養價值進行評價；通過Illumina Miseq測序分析豆豉返霜前后微生物群落多樣性差異，為豆豉的加工儲藏以及食用安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干豆豉(未添加面粉發酵)：利用滬釀3.042米曲霉發酵制成，南昌稻香園調味品有限公司；

硫酸鉀、五合水硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醛溶液：天津市大茂化學試劑有限公司；

葡萄糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

DNS試劑：北京索萊寶生物科技有限公司；

各試劑如無特別說明均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

高速中藥粉碎機：DFY-500型，溫嶺市林大機械有限公司；

恒溫恒濕培養箱：LRHS-200-A型，山東博科生物產業有限公司；

紅外智能消化爐：SKD-08S2型，上海沛歐分析儀器有限公司；

自動凱氏定氮儀：SKD-800型，上海沛歐分析儀器有限公司；

電子分析天平：FA1104N型，上海丙林電子科技有限公司；

多參數測試儀：S220型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計：N-2000型，日本日立公司；

氨基酸分析儀：L-8900型，日本Hitach公司；

PCR儀：GeneAmp?9700型，美國愛普拜斯公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將適量豆豉樣品平鋪于37 ℃，濕度75%的恒溫恒濕培養箱中進行返霜。前期預試驗結果顯示，從第5天開始豆豉表面長出白斑，出現返霜現象，第20天90%以上豆豉都出現返霜，因此選取試驗周期為21 d，從0 d開始每隔3 d取一次樣，共取樣8次，取樣時采取五點取樣法進行取樣后真空包裝，于-80 ℃凍存備用。測定各理化指標時，將豆豉粉碎至無肉眼可見顆粒后進行測定。

1.2.2 水分及灰分百分比的測定 參照GB 5009.3—2016中的直接干燥法測定豆豉中水分百分比。參照GB 5009.4—2016測定豆豉中灰分百分比。

1.2.3 粗蛋白及粗脂肪百分比的測定 粗蛋白含量測定使用凱氏定氮法，具體操作參照GB 5009.5—2016；粗脂肪含量測定使用索氏抽提法，稱取充分粉碎混勻后的試樣3.500 g，移入濾紙筒中進行索氏抽提，具體操作參照GB 5009.6—2016，以上試驗重復3次。

1.2.4 總酸和氨基態氮含量的測定 總酸含量測定使用pH電位法，具體參照GB/T 12456—2008；氨基態氮含量測定使用甲醛滴定法，具體操作參照GB 5009.235—2016，試驗重復3次。

1.2.5 還原糖和總糖含量的測定 參照文獻[10]。

1.2.6 氨基酸含量分析

(1)氨基酸含量測定：稱取粉碎均勻的豆豉粉末0.5 g，加入8% TCA溶液，充分混勻后47 ℃超聲提取1 h，20 000 r/min離心30 min，取5 mL上清液用8%的TCA溶液定容后，20 000 r /min離心30 min，取2 mL濾液，蒸干后加入2 mL 6 mol/L鹽酸溶液，抽真空后置于110 ℃的環境中水解24 h，過濾后蒸干，加入2 mL 0.02 mol/L 鹽酸溶液溶解，用活性炭柱對溶液脫色后再經0.22 μm濾膜過濾后上機測定[11-12]。

(2)營養評價：將所測得的豆豉中必需氨基酸含量換算成每克蛋白質中含氨基酸的毫克數，按式(1)、(2)計算氨基酸評分(AAS)和必需氨基酸指數(EAAI)[13]。

(1)

式中：

n——比較的氨基酸數；

m1——試驗蛋白質的氨基酸含量，mg/g；

m2——雞蛋蛋白質的氨基酸含量，mg/g。

(2)

式中：

m3——試驗蛋白質的氨基酸含量，mg/g；

m4——FAO/WHO模式中氨基酸含量，mg/g。

1.2.7 微生物分析

(1)DNA抽提和PCR擴增：總DNA抽提通過使用E.Z.N.A.?soil試劑盒進行，使用微量紫外分光光度計檢測抽提出的DNA濃度和純度，同時對DNA提取質量進行檢測；細菌采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3-V4可變區進行PCR擴增，真菌基因組DNA采用真菌通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，擴增程序為95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol dNTPs，0.8 μL 5 μmol 引物，0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。

(2)Miseq高通量測序：PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測并利用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega, USA)進行檢測定量后根據Illumina MiSeq平臺(Illumina, San Diego, USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫后進行測序。

(3)生物信息分析：基于上海美吉生物醫藥科技有限公司旗下I-Sanger生信云平臺(https://www.isanger.com/index.html)進行所有的生物信息分析。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3遍，采用Origin 8.6進行作圖，SPSS 22.0軟件分析數據間的顯著性差異，P<0.05則認為樣品間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 返霜過程中基本理化特性變化

返霜過程中豆豉水分和灰分的含量變化如圖1(a)所示，在試驗范圍內豆豉水分含量呈現先上升后逐漸穩定的趨勢，在第9天達到最大值(19.38%)。貯藏9 d后豆豉水分含量略有下降，但基本保持穩定，可能與微生物在代謝過程中消耗了水分和產生的生物熱有關[14]。豆豉在貯藏過程中灰分含量變化較小，可能是因為在返霜過程中，微生物代謝產物積累的程度略有不同[10]。

字母不同表示組間具有顯著性差異(P<0.05)

返霜過程中豆豉粗脂肪和粗蛋白的含量變化如圖1(b)所示，在試驗范圍內豆豉的粗脂肪含量逐漸下降，第21天時粗脂肪含量由最初的15.01%降至11.48%。粗蛋白含量也整體呈下降趨勢且前6 d變化顯著，之后粗蛋白含量為32.18%～33.67%。蛋白質含量整體下降的原因可能是返霜過程中微生物代謝產生相關的酶，將蛋白質分解為氨基酸供自身代謝所用。

由圖1(c)可知，在試驗范圍內豆豉各階段的總糖含量都無顯著性差異。這是因為出廠前的滅酶處理使糖化酶失活，抑制了淀粉的分解。還原糖含量在返霜期間呈下降趨勢，到第21天時由最初的1.23%降至0.93%，這是由微生物代謝導致的[10]。

返霜過程中豆豉總酸和游離氨基態氮含量變化如圖1(d)所示，在返霜前期豆豉的總酸含量降低，是由于培養濕度過大，豆豉吸收空氣中水分導致本身水分含量升高，酸度下降。貯藏12～21 d時酸度略有升高，可能是微生物代謝產生了有機酸。貯藏0～6 d時豆豉中氨基態氮含量上升，與粗蛋白含量變化趨勢相反，說明蛋白質不斷被微生物分解為氨基酸。

2.2 氨基酸含量分析

由表1可知，除色氨酸未測定外(由于測定氨基酸含量時采用酸水解法，會破壞色氨酸)，共檢測到17種氨基酸。返霜過程中豆豉的氨基酸含量為229.624～251.379 mg/g。其中必需氨基酸總量由第0天的97.19 mg/g 降低至第21天的88.21 mg/g，非必需氨基酸由154.19 mg/g減少至141.42 mg/g。但是，必需氨基酸占總氨基酸的比例(EAA/TAA)以及非必需氨基酸占總氨基酸的比例(EAA/TAA)均變化不大，說明豆豉返霜過程中各氨基酸含量均勻減少。貯藏21 d時豆豉中鮮味氨基酸(Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala)和苦味氨基酸占總氨基酸的比例相比于0 d時均變化不大。貯藏15 d時各氨基酸含量有所回升，可能是后期微生物分解蛋白質產生氨基酸的含量大于其代謝所消耗的氨基酸含量。

2.3 必需氨基酸組成評價

食物蛋白質的營養價值評價，不僅要考慮其必需氨基酸含量，同時還要考慮必需氨基酸之間的比例要與人體必需氨基酸含量模式是否接近[15]。由表2可知，未返霜豆豉中亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸含量高于FAO/WHO模式，其余必需氨基酸含量均低于FAO/WHO模式。貯藏6，15，21 d的豆豉中所有必需氨基酸含量均低于FAO/WHO模式，且均低于貯藏0 d時的，說明返霜會導致豆豉中各必需氨基酸的流失，與氨基酸含量變化的結果一致。

表1 豆豉儲存過程中不同樣品氨基酸含量的變化?

? “*”代表必需氨基酸，“EAA”代表必需氨基酸含量，“NEAA”代表非必需氨基酸含量，“TAA”代表總氨基酸含量。

表2 返霜過程中豆豉必需氨基酸組成變化

氨基酸評分越高，其蛋白質營養價值越高，當氨基酸評分越接近100，說明其蛋白質氨基酸組成與FAO/WHO模式氨基酸組成一致[15-16]。由表3可知，豆豉在返霜過程中第一限制氨基酸為甲硫氨酸+半胱氨酸，第二限制氨基酸為賴氨酸。氨基酸評分最高的是苯丙氨酸+酪氨酸，貯藏0，9，15，21 d的必需氨基酸指數(EAAI)分別為77.47，74.33，75.69，70.32。

表3 返霜過程中豆豉氨基酸評分表

2.4 返霜前后微生物組成差異分析

2.4.1 OTU及其豐度分析 為研究各樣本的物種組成，對所有樣本的有效Tags，以97%的一致性進行可操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚類，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋。貯藏0 d豆豉樣品(Y)與貯藏21 d后的返霜豆豉樣品(F)共得到細菌及真菌的有效序列分別為112 334，142 460個，經聚類分析后得到返霜前后細菌OTUs分別是365和267，真菌OTUs分別是122和111。由圖2可知，返霜前后豆豉細菌共有OTU數為226個，約占總OTU數的35.76%；而真菌共有OTU數為41個，占總OTU數的17.60%。后續數據分析，以最小樣本序列數對原始OTU數據進行抽平后再進行分析。

稀釋曲線趨于平緩，說明測序數據量合理，再增加測序量已不太可能檢測到新的微生物種屬，同時微生物的多樣性已經不再有顯著變化[17]。由圖3可知，無論是細菌還是真菌樣品的稀釋曲線隨測序數據量的增加，逐漸趨于平緩，說明本次測序數據量合理。

2.4.2 返霜前后微生物多樣性變化 返霜前后豆豉樣品微生物多樣性系數如表4所示。返霜后，細菌的Sobs、Chao、Ace和Shannon指數均低于原樣，說明隨著返霜的進行豆豉樣品的細菌物種豐富度降低；真菌Ace、Chao、Shannon指數增加以及Simpson指數的減少，說明返霜后豆豉的真菌物種豐富度增加。

圖2 豆豉返霜前后細菌和真菌OTU數目的差異

圖3 細菌和真菌稀釋曲線圖

2.4.3 物種注釋 由圖4(a)可知，返霜前后豆豉樣品中細菌主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成，且返霜后擬桿菌門比例下降。由圖5(a)、(b)可知，返霜后芽孢桿菌屬(Bacillus)占比由68.95%增加至85.54%，還含有0.04%的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、0.24%的埃希氏菌—志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、0.50%的unclassified＿f＿Peptostreptococcaceae、5.46%的Lentibacillus以及4.82%的others(others代表豐度小于0.01的菌屬集合，可以忽略不計)。相比于返霜前，除norank＿f＿Bacillaceae占比基本沒有變化外，其他細菌含量占比均降低，說明返霜有利于芽孢桿菌屬微生物的繁殖且芽孢桿菌屬在返霜前后均占絕對優勢。

表4 返霜前后豆豉OTU水平Alpha多樣性統計表

圖4 返霜前后豆豉細菌和真菌門的水平分布柱形圖

由圖4(b)可知，豆豉真菌組成主要為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、Uclassified＿k＿Fungi，返霜后Uclassified＿k＿Fungi比例上升而擔子菌門比例下降。由圖5(c)、(d)可知，曲霉屬(Aspergillus)變化最大，其占比由66.28%下降至25.40%。返霜前豆豉真菌組成主要是曲霉屬、毛孢子菌屬(Thrichosporon)、Unclassified＿f＿norank、隱球菌屬(Cryptococcus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、橫梗霉屬(Lichtheimia)以及others等。返霜后含量>5%的真菌除了曲霉屬外還有熱子囊菌屬(Thermoascus)、Unclassi-fied＿f＿Davidiellaceae、Unclassified＿f＿Fungi、Purpureocillium、鐮胞菌屬(Fusarium)。返霜后豆豉樣品出現鐮胞菌屬、炭疽菌屬(Colletotrichum)、鏈格孢屬(Alternaria)等植物病原菌，存在一定的食品安全問題。鐮胞菌屬是一類包含許多強破壞性的植物致病真菌且分布廣泛的絲狀真菌，大都能夠產生一些有毒的次生代謝產物，其中真菌毒素就是一種對脊椎動物有毒害作用的次生代謝產物[18]。鏈格孢屬真菌是一類在許多果蔬中均有報道的優勢潛伏侵染菌，能夠引起果蔬腐爛，同時還是一種條件致病菌能夠引起角膜炎、口腔潰瘍、哮喘、皮膚鏈格孢病等多種疾病[19]。

圖5 返霜前后豆豉細菌和真菌屬的水平分布餅圖

3 結論

試驗結果表明，返霜過程中豆豉的基本營養成分不斷流失。返霜后豆豉蛋白質營養價值降低，細菌物種豐富度減少而真菌物種豐富度增加，且出現植物病原屬如鐮胞菌屬、炭疽菌屬、鏈格孢屬等。因此，豆豉在貯藏過程中應盡可能避免高溫、陽光直射以及潮濕的環境，同時可以考慮采用真空包裝以及充入惰性氣體的包裝方式。試驗雖對豆豉返霜過程中各理化指標、氨基酸含量變化和返霜前后微生物多樣性差異進行了研究，但豆豉營養成分與微生物多樣性變化之間的相關性，尤其是與優勢微生物變化的相關性還有待進一步研究，有效抑制返霜的方法也有待探索。