納他霉素的大孔樹脂原位吸附動力學研究

鄭迎瑩 王大紅,2 徐 鵬 沈文浩 張 穎

(1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023;2.河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

食品在貯存中容易引起腐敗變質，添加食品防腐劑是食品保藏的有效手段，近年來，天然防腐劑的研究與使用逐漸吸引了人們的注意力，并已成為食品保藏研究的熱點[1-2]。納他霉素是由納塔爾鏈霉菌等鏈霉菌發酵產生的一種二十六元多烯大環內酯類物質，對幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抗性，并能抑制真菌毒素的產生[3]，具備高效、安全、穩定性高等優良性質，有著巨大的應用前景和生產價值，到目前為止已被全球大多數國家批準作為食品防腐劑使用[4]。納他霉素的生產主要采用發酵法，由于納他霉素的產量較低，工業化生產進展緩慢，導致價格較高，目前其主要集中應用于高附加值的產品中[5]。

納他霉素是胞內產物，在其生物合成過程中，由于菌體細胞和胞內的酶都受到高濃度產物納他霉素的反饋抑制作用，使得生物細胞及酶的潛力不能充分發揮，導致納他霉素的產率和原料的轉化率難以提高。目前，有關納他霉素的研究[6-7]多集中在采用菌株選育、發酵條件和工藝優化、代謝調控等方式提高發酵產量上，而在發酵產物分離和產物抑制等方面研究較少。原位分離技術是一種將生物合成與目標代謝產物分離相耦合的技術，已受到中國研究者的重視，該技術可選擇性地從發酵液中連續分離有抑制性或者有毒性的代謝產物，不僅能夠減弱終產物的反饋抑制作用，同時還能提高產物的回收率，減少有機溶劑的使用，其中采用大孔吸附樹脂的原位分離技術應用較為廣泛[8]。大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及有機溶劑的有機高分子聚合物，是一種新型分離材料，已廣泛應用到天然產物的提取分離、藥物、環境保護等方面[9]。目前，大孔吸附樹脂已被用于納他霉素的純化中，如魏寶東等[10]采用甲醇做溶劑，從發酵液中提取納他霉素，然后采用D101大孔吸附樹脂進一步純化，回收率為82.12%，純度為 91.2%；但到目前為止，還未見采用大孔樹脂原位吸附的方法弱化或移除發酵過程中納他霉素的反饋來提高納他霉素產量的報道。該技術在其他微生物源代謝產物的發酵過程中已被廣泛使用，如：在普那霉素發酵過程中添加JD-1大孔樹脂能吸附發酵液中90%的普那霉素，使普那霉素的發酵產量從0.29 g/L提高到1.03 g/L[11]；在琥珀酸發酵過程中加入40 g/L D301R 樹脂，至發酵終點琥珀酸產量達到49.46 g/L，相比普通發酵過程，底物轉化率提高了21%[12]。試驗采用StreptomycesnatalensisHW-2為納他霉素生產菌株，以建立納他霉素的發酵和分離耦合體系為目的，通過篩選對納他霉素具有良好吸附效果的大孔吸附樹脂，探討大孔吸附樹脂原位分離技術發酵納他霉素的可行性，并對這一過程的靜態吸附動力學行為進行研究，獲得最佳工藝參數，為納他霉素的生產和分離提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)HW2：實驗室保藏；

HPD100、HPD300、HPD450和HPD600大孔樹脂：滄州寶恩公司；

D101大孔樹脂：海光化工有限公司；

AB-8大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司；

XAD-16HP大孔樹脂：美國羅門哈斯公司；

NKA和HZ816大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；

斜面培養基：葡萄糖10 g/L，麥芽浸粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2；

種子培養基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，麥芽浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2；

發酵培養基：葡萄糖30 g/L，酵母浸膏2 g/L，牛肉膏10 g/L，pH 7.2；

甲醇：分析純，天津德恩化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，西隴科學股份有限公司；

葡萄糖：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

分析天平：ME104E /02型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 斜面上生長成熟的孢子制成孢子懸液，按照體積分數2%的比例接種于種子培養基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養48 h；將培養好的種子液按體積分數6%的比例接入發酵培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養120 h。

1.2.2 納他霉素的提取 取發酵液與甲醇按體積比1∶9比例混合，28 ℃、180 r/min振蕩解吸2 h，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，得待測液；取出樹脂，洗滌過濾，晾干，放入發酵液等體積的甲醇中，解吸(方法同上)，10 000 r/min離心10 min，得到待測樣品。

1.2.3 納他霉素含量的測定 采用高效液相色譜法，液相條件為：YMC-Pack ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)，流動相為甲醇—水(體積比75∶25)，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長304 nm。

1.2.4 大孔樹脂預處理 參照文獻[13]。

1.2.5 大孔樹脂含水量測定 試驗用樹脂為干樹脂，稱取預處理過的大孔樹脂10 g，60 ℃烘至恒重，并按照文獻[13]的方法計算各樹脂的含水量。不同樹脂的物理性質及含水量見表1。

表1 不同樹脂的性質和含水量

1.2.6 靜態吸附試驗 根據文獻[14]修改如下：取預處理過的干樹脂各2 g，分別加入裝有30 mL 50 mg/L納他霉素水溶液的三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩吸附12 h。取0.2 mL上清液加1.8 mL甲醇，0.22 μm微孔濾膜過濾，測定納他霉素的含量，分別根據式(1)、(2)計算樹脂吸附量及吸附率。

(1)

(2)

式中：

Q——吸附量，mg/g干樹脂；

C0——納他霉素初始質量濃度，g/L；

C1——吸附后溶液中納他霉素質量濃度，g/L；

V——溶液體積，mL；

m——大孔樹脂質量，g；

η——吸附率，%。

1.2.7 靜態解吸試驗 根據文獻[15]修改如下：選用甲醇作為納他霉素的解吸劑，將充分吸附的大孔樹脂過濾，用去蒸餾水沖洗后濾干置于裝有30 mL甲醇的150 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩12 h，取樣并測定解吸液中納他霉素含量，根據式(3)計算解吸率。

(3)

式中：

W——解吸液中納他霉素質量濃度，mg/L；

Q——吸附總量，mg；

V——解吸液總體積，L；

η′——解吸率，%。

1.2.8 靜態吸附等溫曲線的測定 根據文獻[16]修改如下：配置濃度為30，50，70，90，110，130，150 mg/L的納他霉素溶液各30 mL，分別置于裝有2 g大孔樹脂的250 mL 三角瓶中，25 ℃、120 r/min振蕩吸附2 h。取出充分吸附的大孔樹脂置于裝有30 mL甲醇的250 mL三角瓶中180 r/min、25 ℃解吸2 h，測定納他霉素含量，以初始濃度(mg/L)對平衡后吸附量(mg/g干樹脂)做圖，可得到納他霉素的吸附等溫線。

1.2.9 大孔樹脂原位發酵工藝的優化 根據以上優化得到的最佳大孔吸附樹脂，固定發酵條件，選擇樹脂添加量和添加時間作為影響納他霉素產量的主要因素，進行納他霉素發酵和大孔樹脂原位吸附過程耦合，根據大孔樹脂中納他霉素的質量濃度選取最佳工藝條件。

(1)樹脂添加量：按照初始發酵條件，將培養好的種子液按體積分數6%的比例接入發酵培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養120 h，樹脂添加量分別設為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/30 mL，樹脂在發酵開始時加入，進行發酵，發酵結束后，取出大孔樹脂，將大孔樹脂解吸12 h，測定納他霉素質量濃度。

(2)樹脂添加時間：按照初始發酵條件，將培養好的種子液按體積分數6%的比例接入發酵培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養120 h，選用最佳樹脂添加量，樹脂添加時間分別設為24，36，48，60，72 h進行發酵，發酵結束后，取出大孔樹脂，將大孔樹脂解吸12 h，測定納他霉素質量濃度。

1.3 數據處理

數據分析和圖表繪制均采用 Origin 2017 軟件處理。

2 結果與分析

2.1 樹脂的靜態吸附與解吸

大孔吸附樹脂主要靠其大孔網狀結構和較大的比表面積對溶液中的溶質進行吸附。在模擬發酵過程，對9種大孔吸附樹脂進行模擬原位吸附分離，通過測定樹脂吸附和解吸前后溶液中納他霉素的濃度，計算各樹脂的吸附量、吸附率和解吸率。如表2所示，9種樹脂對納他霉素均具有吸附作用，其中HPD600、HZ816和AB-8對納他霉素的吸附量、吸附率和解吸率較低；HPD100、HPD450和XAD-16HP樹脂對納他霉素的吸附量均達到了0.71 mg/g干樹脂以上，但HPD100和XAD-16HP樹脂的解吸率相對較低；弱極性樹脂HPD300吸附率較HPD450低，但解吸率最高達到了95.22%，說明HPD300和HPD450樹脂與納他霉素的極性相似。綜合考慮樹脂的吸附率、解吸率和吸附量，選用HPD300和HPD450兩種樹脂進行下一步研究。

表2 不同樹脂對納他霉素的吸附率、解吸率及吸附量

Table 2 Adsorption rate, desorption rate and adsorption capacity of natamycin by different resins

樹脂名稱吸附量/(mg·g-1DryResins)吸附率/%解吸率/%HPD1000.7295.7173.01HPD3000.6383.4795.22HPD6000.5573.8282.56D1010.6991.9386.45HPD4500.7296.1485.42AB-80.5471.8588.09NKA0.6992.3275.59HZ8160.6384.3872.85XAD-16HP0.7194.5081.75

2.2 樹脂的靜態吸附動力學曲線

以吸附率為縱坐標，吸附時間為橫坐標作圖，得到HPD300和HPD450兩種樹脂的靜態吸附動力學曲線。從圖1可以看出，HPD300和HPD450兩種樹脂在0.5～2.0 h時吸附率逐漸增大，2 h后樹脂對溶液中納他霉素的吸附率變化不大，4 h以后吸附率隨時間變化基本上達到吸附平衡，HPD450型樹脂吸附率較大，達到了96.14%，而HPD300樹脂吸附率為85.42%，表明這兩種樹脂對納他霉素的吸附是快速平衡型。

2.3 樹脂的靜態解吸動力學曲線

采用甲醇對上述兩種達到吸附平衡的樹脂進行解吸，每20 min測定解吸液中納他霉素的濃度，連續測定160 min，以樹脂的解吸率為縱坐標，解析時間為橫坐標，得到HPD300和HPD450樹脂的靜態解吸動力學曲線。從圖2中可以看出，HPD300和HPD450樹脂都在起始階段對納他霉素的解吸率變化幅度較大，2.0 h后解析率變化幅度較小，HPD450樹脂在4.5 h時達到最大87.25%，而HPD300樹脂在5.0 h時達到最大95.36%，解吸液中納他霉素的質量濃度基本不變，但是由于樹脂物理性質各方面的差異，HPD300樹脂解吸率比HPD450樹脂高出8.11%。綜合以上研究結果，HPD450樹脂的吸附率和解吸附率的整體效果比HPD300更佳，為最優選擇樹脂，進行后續研究。

圖1 靜態吸附動力學曲線

圖2 靜態解吸動力學曲線

2.4 樹脂的靜態吸附等溫線

以HPD450樹脂為研究對象，以納他霉素的起始質量濃度對平衡后的吸附量作圖，可得到納他霉素的質量濃度<150 mg/L時的吸附等溫線。如圖3所示，溫度為25 ℃時，隨著納他霉素初始濃度的增加，HPD450樹脂的吸附量也隨之增加。吸附過程是溶質分子在吸附劑與溶劑兩相界面上進行分配的過程，在一定溫度下，當吸附過程達到平衡時，溶質分子在液相和固相中的濃度關系可用吸附等溫方程式來表示，常用的是Langmuir模型和Freundlich模型。Langmuir模型是假設大孔樹脂表面為單層吸附、被吸附物質均勻分布、物質在大孔樹脂的表面沒有分子相互作用；Freundlich模型為非理想狀態的吸附模型，該模型為單分子層吸附和非單層吸附行為，被用于化學吸附和物理吸附的過程中[17]。HPD450樹脂的靜態吸附等溫線的Langmuir和Freundlich擬合曲線中相關系數(R2)的值分別為0.996和0.957，兩者R2差別不大，但是Freundlich曲線的吸附強度<<1，說明HPD450樹脂的吸附更符合Langmuir模型，是單分子層吸附，最大吸附量為10.03 mg/g干樹脂。

圖3 HPD450樹脂的吸附等溫線

2.5 原位分離條件優化

2.5.1 樹脂的添加量 比較了不同樹脂添加量的發酵—分離耦合工藝，HPD450樹脂在發酵開始時加入發酵液中，結果如圖4所示。在樹脂添加量為0.5～4.0 g/30 mL時，納他霉素的產量隨著樹脂添加量的增加而提高，當樹脂的添加量為4.0 g/30 mL時，納他霉素的產量最高達1.15 g/L，比對照(0.83 g/L)提高了38.56%，隨著樹脂添加量的進一步增加到5.0 g/30 mL時，而納他霉素的產量卻沒有明顯變化。從結果可以看出，在發酵—吸附分離耦合過程中，HPD450樹脂的添加可以有效提高納他霉素的發酵水平，并且使菌體內的納他霉素維持在較低水平，降低了納他霉素的產物抑制作用，為底物的高效轉化提供了良好的基礎。王衛等[18]報道在赤霉素發酵過程中，最佳D100樹脂的加入量為2%，過多的樹脂加入后，會影響菌絲生長，導致目標產物的產量下降。

2.5.2 樹脂添加時間 在HPD450樹脂添加量為4 g/30 mL的條件下，考察加入時間對納他霉素原位吸附的影響。由圖5可知，在發酵后48 h添加時，納他霉素的發酵產量最高，達到1.38 g/L，與初始添加的相比，納他霉素的產量提高了27.78%，比不添加樹脂時提高了66.27%；發酵后60，72 h添加時，納他霉素的產量卻在下降。分析原因，在發酵前期以菌體生長為主，大孔樹脂的過早加入可能對納塔爾鏈霉菌的生長有一定的影響，進而影響納他霉素的產生；加入過晚，產物抑制已經形成，而且發酵液中的其他成分可能被大孔樹脂吸附，使其吸附容量變小，從而減少了納他霉素產量。徐浩等[19]報道在Nisin發酵過程中，D113樹脂加入過早在一定程度上影響細胞生長；而加入過晚，產物抑制已經在一定程度上形成，從而導致Nisin產率也偏低。

圖4 發酵液中樹脂添加量對納他霉素合成的影響

Figure 4 Effect of resin addition content in fermentation broth on synthesis of natamycin

圖5 添加時間對納他霉素合成的影響

3 結論

研究結果表明，HPD450型大孔樹脂為納他霉素的最佳吸附劑，采用該大孔樹脂原位吸附分離耦合納他霉素的發酵，納他霉素產量提高明顯，優化后比不添加樹脂時提高了66.27%，該結果也證實在納他霉素的發酵過程中存在產物反饋抑制現象；利用該大孔樹脂優良的富集和解吸性能，可以大量減少在納他霉素提取過程中甲醇的使用，簡化發酵液預處理流程，從而提高納他霉素的得率。但目前納他霉素的發酵與樹脂吸附的耦合技術僅處于搖瓶試驗階段，而且StreptomycesnatalensisHW-2在發酵過程中菌絲容易纏繞形成小球，導致大孔樹脂與菌絲無法有效分離，同時，HPD450型大孔樹脂還存在非特異性吸附現象，從而影響納他霉素的發酵和樹脂的使用效率，進而導致該方法在納他霉素工業化應用困難。因此，如何減少發酵過程中菌絲球的形成和開發易于從發酵體系中回收的新型大孔樹脂，提高耦合發酵中大孔樹脂的利用率，將是納他霉素生物合成與樹脂分離相耦合技術的進一步研究方向。