喹啉高效降解菌株Alcaligenes sp. WUST-qu的篩選、鑒定及降解特性

劉建忠，易紅磊，翟 赟，黃 皓，陳 俊，周 衛，秦曉蓉

(武漢科技大學 化學與化工學院,武漢 430081)

喹啉及其衍生物是一類重要的工業原材料和溶劑，廣泛存在于煤焦油、頁巖、石油等物質中[1-2]，用途包括醫藥、染料、油漆、木材加工等行業。喹啉在醫藥上主要用于制造煙酸系、8-羥基喹啉系和奎寧系三大類藥物，其中的代表之一就是為眾人所熟知的、全球廣泛使用的抗瘧疾特效藥奎寧。與之同時，喹啉及其衍生物又是一類典型的環境污染物，具有難降解、有毒、致畸甚至致癌的作用。研究表明，4-硝基喹啉-1-氧化物不僅會對小麥和蠶豆的發芽率、出苗率和苗高有明顯的抑制作用，而且會誘發其根尖細胞染色體發生畸變[3-4]，該物質還能誘發大鼠舌黏膜發生癌變[5]。

微生物生物技術用于環境污染的治理具有生態友好和經濟有效等特點，已成為現代工業可持續發展的重要技術保障之一。篩選能高效降解一種或幾種特定有機污染物的菌株，并添加到活性污泥中以實現對特定污染物高效降解的生物強化作用具有重要意義[1-2,6]。本研究從武漢某焦化廠污水處理系統曝氣池的活性污泥中篩選到一株喹啉高效降解菌，并對該菌株進行形態學、分類地位、降解特性和生長動力學研究。

1 材料與方法

1.1 活性污泥的采集

用于分離目標菌株的活性污泥采集自武漢某焦化廠污水處理系統曝氣池，具體做法為采用長柄勺舀曝氣池面上0～20 cm處的活性污泥，盛入事先準備好的塑料桶，帶回實驗室用于后續處理。

1.2 培養基

培養基包括LB液體培養基，無機鹽培養基(Mineral salt medium,MSM)，MSM固體/斜面培養基，微量元素培養液等，其各自的成分和配制參照文獻[7]完成，經高壓滅菌后待用。

1.3 菌種的富集、馴化和分離

采用文獻[8]介紹的篩選苯酚降解菌的方法完成菌種的富集、馴化和分離。

1.4 菌株的革蘭氏和芽孢染色

參照文獻[7]完成。

1.5 掃描電鏡樣品的制備及觀察

用于掃描電鏡觀察的樣品經戊二醛(2.5%)固定、磷酸鹽緩沖溶液洗滌(3次，每次5 min)、體積分數依次增加的乙醇脫水 (20%，50%，70%，85%，95%，100%；每體積分數下脫水10 min)、叔丁醇置換2～3次(φ=100%，每次10 min)、真空干燥40～60 min，噴金觀察。掃描電鏡為Nova 400 NanoSEM，FEI(美國)，工作電壓為15 kV。

1.6 菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列的測定及系統發育樹的構建

菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列由武漢擎科創新生物技術有限公司測定。擴增所使用的引物的核苷酸序列為：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′)，擴增產物的大小約為1 400 bp。使用BLAST程序對美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中的16S rRNA基因核苷酸序列進行搜索，并使用“分子進化遺傳分析(MEGA 5.0)”軟件分析序列，應用ClustalW算法進行逐對和多重序列比對，利用鄰接法(Neighbour-joining method)構建系統發育樹。

1.7 菌體生物量、喹啉和苯酚質量濃度的測定

菌體生物量是采用分光光度計(UV-2000，日本)測定培養液于600 nm處的吸光值，并通過事先建立的菌體干質量與OD600的校正曲線進行計算；喹啉的測定方法是比色法，參比為不含喹啉的MSM，測定波長為277 nm；苯酚的測定采用4-氨基安替吡啉法，參比為不含苯酚的MSM，測定波長為510 nm。

1.8 種子液的制備

在500 mL三角瓶中，加入質量濃度為500 mg·L-1的喹啉/苯酚的MSM 200 mL，接入1 mL 菌株WUST-qu培養液，在中性pH和37 ℃、150 r·min-1培養條件下培養，直到對數生長晚期。將培養液轉入50 mL離心管，以 8 000 r·min-1的轉速離心5 min以回收菌體，用20 mL MSM重新懸浮沉淀，以相同的條件離心回收菌體，重復2次。以適量MSM重懸沉淀，并將懸液的OD600調整至1.0，以之為降解試驗中的種子液，接種量為培養液總體積的5%。

1.9 菌體生長動力學

測定每個喹啉質量濃度下不同時間的生物質質量濃度，通過對指數生長期的生物質質量濃度與培養時間的半對數作圖做線性最小二乘回歸(Linear least-square regression)，擬合出菌體的比生長速率；采用軟件 Origin 8.0，將菌株的比生長速率與對應的底物質量濃度進行非線性最小二乘擬合得到Haldane方程中的各參數。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經過連續的富集、馴化和梯度稀釋涂布添加500 mg·L-1喹啉的MSM瓊脂平板，獲得55個單菌落，經在添加相同質量濃度喹啉的MSM瓊脂平板上劃線純化后，將每一菌落分別于MSM斜面培養基和添加φ=20%甘油的MSM中于-80 ℃保存。之后對獲得的所有菌落逐一進行以喹啉為唯一碳源的搖瓶培養試驗。結果表明，編號為Qu-12的菌株顯示突出的喹啉降解能力，將其命名為WUST-qu，并用于后續的研究。該菌株革蘭氏、芽孢染色結果如圖1和圖2所示，掃描電鏡放大20 000倍和50 000倍的結果如圖3所示。

圖1 菌株WUST-qu革蘭氏染色結果Fig.1 The Gram stain of the bacterial strain WUST-qu

圖2 菌株WUST-qu芽孢染色結果Fig.2 The spore stain of the bacterial strain WUST-qu

圖3 菌株WUST-qu的掃描電鏡圖(A.20 000倍,B.50 000倍)Fig.3 The scanning electron microscope image of bacterial strain WUST-qu (A.20 000×; B.50 000×)

由圖1可見，菌株經革蘭氏染色后呈粉紅色，表明該菌株為革蘭氏陰性菌；由圖2可見，菌株經芽孢染色后呈綠色，表明該菌株產芽孢。由圖3可見，該菌株呈典型的桿狀菌的特征，長為1.15 μm±0.08 μm，寬為0.26 μm±0.01 μm，無可見的鞭毛。菌株WUST-qu 16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 435 bp)已提交到GenBank，登錄號為MF099860。核苷酸序列比對結果表明，該菌株16S rRNA基因與產堿桿菌屬菌株M14和JASI的同源性均高達99%，故將該菌株鑒定為產堿桿菌屬(Alcaligenesfaecalis)，采用鄰接法構建的系統發育樹如圖4所示。

圖4 基于16S rRNA基因核苷酸序列同源性構建的菌株WUST-qu系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of bacterial strain WUST-qu based on the nucleotide homology of its 16S rRNA gene

2.2 菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的特征

環境pH是影響受污染地點生物修復效果的重要因素之一，因而測定菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的降解特征。菌株WUST-qu于MSM初始pH為5.0～9.0時降解不同初始質量濃度喹啉的特征以及在降解過程中生物質增長的特征如圖5所示。

由圖5可見，MSM初始pH為5.0時，菌株WUST-qu能在24、30、36和60 h之內分別將初始質量濃度為100、200、300和400 mg·L-1的喹啉完全降解，在降解不同初始質量濃度的喹啉時均呈現出明顯的生長延滯期(12～30 h)，延滯期有隨喹啉初始質量濃度提高而延長的趨勢；與MSM初始pH為5.0相比，MSM初始pH為6.0時，酸性環境對菌株WUST-qu所產生的脅迫作用明顯減弱，菌株降解喹啉的活力得到明顯提升。能夠完全降解喹啉的最高質量濃度由之前的400 mg·L-1提升到600 mg·L-1，完全降解低質量濃度喹啉所需要的時間明顯縮短，延滯期也有所縮短，但對于初始質量濃度為600 mg·L-1的喹啉，菌株依舊呈現出較長的生長延滯期(30 h)；中性pH明顯有利于菌株WUST-qu對喹啉的降解，能夠在接種后48 h內將初始質量濃度為700 mg·L-1的喹啉完全降解，700 mg·L-1是該菌株能夠完全降解喹啉的最高質量濃度，菌體生長的延滯期較之pH 5.0和6.0時大為縮短；菌株WUST-qu在MSM初始pH為8.0時降解不同初始質量濃度喹啉和在降解過程中生物質的變化特征與MSM初始pH為7.0時如出一轍，不再贅述。這在很大程度上表明，中性或者略偏堿性(7.0～8.0)是該菌株降解喹啉的理想pH范圍；MSM初始pH為9.0時，菌株WUST-qu降解初始質量濃度為600 mg·L-1以下的喹啉都尚屬順暢，只是完全降解初始質量濃度為600 mg·L-1的喹啉所需的時間較初始pH為7.0時延長6 h，而完全降解初始質量濃度為700 mg·L-1的喹啉所需的時間則大幅度延長24 h之多。菌體生物質增長特征與初始pH為7.0時相比，差異很小，最明顯的差異莫過于初始喹啉質量濃度為700 mg·L-1的試驗組的延滯期延長30 h之多，但一旦越過延滯期之后，菌體生物質呈指數增長，與之相伴隨的是喹啉被快速降解。

圖5 菌株WUST-qu在MSM初始pH為5.0～9.0、降解不同初始質量濃度喹啉時的降解曲線和生物量的增長曲線Fig.5 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading quinoline at different initial mass concentrations at initial pH of between 5.0-9.0

2.3 菌株WUST-qu降解苯酚的特征

關于菌株WUST-qu底物廣譜性的研究表明，該菌株不僅能夠有效降解喹啉，還能有效降解苯酚。菌株于MSM初始pH為8.0，于35 ℃和150 r·min-1的旋轉搖床上培養時，降解不同初始質量濃度苯酚以及在降解過程中生物質的增長特征如圖6所示。

由圖6可見，菌株WUST-qu能夠在8、20、24和32 h之內分別將初始質量濃度為100、300、500和700 mg·L-1的苯酚完全降解，但即便是降解初始質量濃度僅為100 mg·L-1的苯酚，菌株WUST-qu也顯示出4 h的延滯期，而且隨著苯酚初始質量濃度的提高，延滯期逐漸延長。

2.4 菌株WUST-qu以喹啉為唯一碳源時的生長動力學

菌株比生長速率與喹啉初始質量濃度的關系如圖7所示。

圖6 MSM初始pH為8.0時菌株WUST-qu降解不同初始質量濃度苯酚時的降解曲線和生物量的增長曲線Fig.6 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading phenol at different initial mass concentrations at initial pH of 8.0

從圖7可見，比生長速率先是隨著喹啉初始質量濃度的提高而增加，到達某一質量濃度后(即到達Sm值后)， 隨喹啉質量濃度的升高而降低，最大比生長速率對應的喹啉質量濃度為55.545 mg·L-1。其他參數如下：μmax= 1.657 6 h-1，Ks= 36.42 mg·L-1，Ki= 81.418 mg·L-1，R2= 0.968。

3 討 論

本研究報道的菌株WUST-qu能夠完全降解喹啉的最高質量濃度為700 mg·L-1，雖不及鄭中原等[9]和Sun等[2]的結果，但高于絕大多數公開報道的結果[1,10-11]。這些較低的數值與喹啉在水中的溶解性較差有關，也充分反映出喹啉的難降解性；與其同屬含氮雜環化合物的吡啶，能與水以任意比例互溶，文獻[12]報道的微生物能夠完全降價吡啶的濃度高達70 mmol·L-1(質量濃度5 537 mg·L-1)。關于微生物降解喹啉的機理，已有很多有益的探索。不同種屬的微生物降解喹啉的途徑可能不盡相同，但大的方面是一致的。概括的途徑是喹啉經兩次羥基化，產物分別為2-羥基喹啉和2,8-二羥基喹啉，后者被轉化為8-羥基香豆素和3-(2,3-二羥基苯基)丙酸，并進一步被礦化為CO2和H2O。在本研究中，也采用GS/MS對代謝產物進行監測，檢測到2-羥基喹啉的存在，但沒有檢測到其他代謝中間產物。

圖7 菌株比生長速率與喹啉初始質量濃度的關系Fig.7 The relationship between the specific growth rates of the bacterial strain and the initial mass concentrations of quinoline

盡管菌株WUST-qu也能有效降解苯酚，但其降解效率卻不及筆者之前篩選到的以降解苯酚為目標的菌株Pseudomonassp. WUST-C1[8]，后者能在接種后4 h和32 h內將初始質量濃度分別為200 mg·L-1和為1 200 mg·L-1的苯酚完全降解，而且在降解較低質量濃度的苯酚(< 400 mg·L-1)時不表現出延滯期。有研究表明[13]，在有氧條件下，微生物降解苯酚的第一步是在羥化酶的作用下，將苯酚轉化為鄰苯二酚，隨后，鄰苯二酚通過鄰位或間位裂解途徑開環。而喹啉微生物降解的起始也包含兩步連續的羥基化，并進而轉化為2,8-二羥基喹啉。這種代謝途徑上的相似性是解釋菌株WUST-qu既能有效降解喹啉又能有效降解苯酚可能的機理之一。

生長動力學知識對于了解微生物降解喹啉的能力是極其重要的。Haldane動力學方程常用于描述抑制性底物在純培養或混合培養時的細胞生長速率。為了獲得菌體生長的動力學模型參數，測定喹啉初始質量濃度為50～700 mg·L-1時不同時間的生物質質量濃度，通過線性最小二乘回歸擬合出菌體的比生長速率，通過非線性最小二乘擬合得出Haldane方程中的μmax、Ks和Ki值。Zhu等[10]采用Haldane模型研究一株紅球菌屬菌株QL2以喹啉為底物生長時的動力學，獲得的相關參數分別為：μmax= 0.499 h-1，Ks= 68.7 mg·L-1，Ki= 387.1 mg·L-1；李靜等[14]報道一株嗜酸菌屬菌株降解喹啉的Haldane動力學參數：μmax= 0.640 h-1，Ks= 164 mg·L-1，Ki= 253 mg·L-1。本研究中的菌株WUST-qu的最大比生長速率遠高于Zhu等[10]和李靜等[14]報道的結果，這意味著WUST-qu可以在含高質量濃度喹啉的工業廢水中快速生長，并因此迅速降解喹啉，顯示出在應對喹啉污染突發事件中較大的應用潛力。