金櫻子丙酮、甲醇、乙醇超聲提取物抗EV71和RSV病毒分析

李 菁，朱 雪，欒菁菁，張曉平，2*

(1．山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250300;2．山東中醫藥大學 青島中醫藥科學院，山東 青島 266112)

金櫻子又名刺榆子、刺梨子、金罌子、山石榴、山雞頭子、糖罐，為薔薇科薔薇屬植物金櫻子(Rosa laevigata Michx．)的干燥成熟果實。主要產于四川、湖南、廣東、江西。10～11月果實成熟變紅時采收，干燥，除去毛、刺、核用。其氣微，味甘、微澀。以個大，色紅黃者為佳。生用。金櫻子藥性酸、甘、澀、平，歸腎、膀胱、大腸經，具有固精縮尿［1］、收斂止瀉［2］的功效，主治腎虛精關不固之遺精滑精，膀胱失約之遺尿尿頻，沖任不固之崩漏帶下，脾虛之久瀉久痢。據《本草新編》等典籍記載，“遺精夢遺之癥，皆尿竅閉而精竅開，不兼用利水之藥以開尿竅，而僅用澀精之味以固精門，故愈澀而愈遺也”，其具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉等功能。其主要化學成分有多糖、黃酮［3］類物質、三萜類及其衍生物［4］等。金櫻子在我國也有較多研究。隨著現代科技的不斷進步，對金櫻子的研究更加深入，對其功效也有了進一步的了解。

本研究立足于在丙酮、甲醇、乙醇溶劑中金櫻子提取物含量的測定，通過分析其提取物對于病毒活性的抑制作用，發現金櫻子抗病毒作用的優勢，為開發金櫻子作為抗病毒活性藥物奠定基礎。

1 儀器及材料

1．1 材料

金櫻子藥材(購置于漱玉平民大藥房，經相關專家鑒定其滿足本實驗要求)。

1．2 受體細胞以及侵染病毒

Hep2(人喉表皮樣癌細胞，為RSV受體細胞)、RD(人橫紋肌肉瘤細胞，為EV71受體細胞)、呼吸道合胞病毒、手足口病毒為山東省醫學科學院基礎醫學研究所提供，本實驗室培養保存。

1．3 試劑

細胞培養液(美國 HyClone公司，批號:AAJ207653)，含10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素，除菌，分別置于4℃下備用;細胞維持液(美國 HyClone公司，批號:AAJ207653)，含2%新生牛血清及100 U/mL青霉素及鏈霉素，除菌，分別置于4℃儲存備用);新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號:141013);PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司，批號:AAK2－8442);EDTA－0．25%胰酶(美國Gibco公司，批號:1737903);CCK－8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，編號:C0039);DMSO(amresco公司，批號:2705C127);丙酮(分析純)，甲醇(分析純)，乙醇(分析純)。

1．4 儀器

CO2恒溫培養箱(上海力申科學儀器有限公司，批號:HF90);生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司，批號:HFsafe－1200TE);倒置顯微鏡(Olympus公司，批號:CKX－31);酶標儀(Molecular Device，Spectra Max M5)。

2 實驗方法

2．1 供試品溶液的制備

取4份干燥的金櫻子藥粉20 g，過60目篩;分別用200 m L水、丙酮、甲醇、60%乙醇超聲提取30min，抽濾，濾液干燥，取產物用2%的二甲亞砜溶液配成16 mg/mL的供試品溶液待用。

2．2 藥物對細胞毒性的測定

用2%維持液將供試品藥物按二倍比稀釋10個濃度梯度，在已經長好細胞的96孔板上依次接種，并設置4個復孔、空白對照孔和細胞對照孔，在37℃、5%CO2病毒培養箱中培養，置于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態，當細胞出現90%的病變時停止培養，每孔加10μLCCK－8進行染色處理，置于37℃、5%CO2培養箱中培養3 h，使用酶標儀在450 nm波長測定吸光度OD值。運用Reed－Muench公式，計算藥物半數中毒濃度TC50，并確定細胞存活率在90%以上的最大無毒濃度TC0。

相關計算公式:

細胞存活率=(OD各組－OD病毒對照)/OD正常細胞×100%

細胞病變率=1－細胞存活率

細胞比距=(高于50%病變率－50%)/(高于50%病變率－低于50%病率)×100%

TCID50=Antilg(lg高于50%病變的病毒最高稀釋度+細胞比距×稀釋因子對數)

2．3 藥物對被侵染細胞作用

供試品從無毒濃度起用2%1640培養基，按二倍比系列稀釋10個濃度，以每孔100μL的量接種在已經長成單層細胞的96板孔上，每孔再加100μL100倍TCID50的病毒液，同時設陽性對照組(利巴韋林)、病毒對照組及空白對照組，每組4個復孔，置于37℃、5%CO2病毒培養箱中培養，每隔2 h于倒置顯微鏡下觀察一次細胞對照，待病毒對照出現90%以上的病變時，停止對細胞培養的培養，每孔加10μLcck－8進行染色處理，用酶標儀在450 nm波長測定吸光度A值。應用Reed－Muench公式計算藥物半數有效濃度(EC50)和治療指數(TI)。

EC50=［Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值－比距)］×C

治療指數(TI)=半數毒性濃度(TC50)/半數有效濃度(EC50)

3 實驗數據及結果

圖1 EV71侵染RD細胞

圖2 RSV侵染Hep2細胞

表1 抗病毒作用結果

由表1可知，三種超聲提取物對兩種病毒均有抑制作用，對EV71的作用效果要優于RSV，其中，60%乙醇超聲提取物對兩種病毒的抑制作用均較其他兩種提取方式好，其TI值分別為6．10和6．19;丙酮超聲提取物對兩種病毒的抑制作用較差，其TI值分別為4．51 和5．08。

4 討論

據臨床統計，病毒所導致的疾病在所有感染性疾病中所占的比例高達75%以上［5］，因此，抗病毒治療異常重要。然而，病毒對大多數抗生素等西藥并不敏感，而且西藥費用昂貴，服用后不良反應也比較大。中醫藥對病毒具有多重作用，很少產生耐藥性，不良反應較小，價格低廉，部分藥物還兼有解熱、增強機體免疫功能等優勢［6］。目前，據有關文獻資料報道，抗病毒中藥［7］在臨床中的應用，幾乎已經遍及國內目前常見的病毒感染性疾病，如流行性感冒、傳染性肝炎、流行性乙型腦炎、流行性出血熱、病毒性心肌炎、病毒性腸炎、流行性腮腺炎等［8］，治療效果顯著。

近年來，隨著禽流感病毒感染、流行性出血熱、埃博拉(Ebola virus)寨卡病毒等的出現和蔓延，中藥抗病毒研究再次成為熱點。目前，對中藥抗病毒［9］研究主要集中于從中藥中分離的化學單體;單味中藥及其提取物;中藥復方制劑等。從有效成分分布來看，幾乎遍及生物堿類、黃酮類、苷類、揮發油、有機酸、氨基酸、酚、醛、鞣質、蛋白質、多糖和單糖等。金櫻子水煎液中含有 Mn、Ca、Fe 、Mg 、Cu、Zn、Ni、Cr、Co 9 種微量元素［10］，其中 Mn、Ca、Fe 3種元素具有統計學意義，而其他元素溶出比較少。研究發現金櫻子的活性成分主要為有機酸、多糖、黃酮類物質、三萜類及其衍生物等，藥理作用主要有抗氧化、抗菌、抗炎、免疫活性、降糖降脂等作用［11］。金櫻子是一種藥食兩用植物［12］，不僅含有糖、酸、蛋白質、維生素等多種營養成分，而且含有類黃酮、多糖和糖苷元、三萜類有機酸、烏所酸、齊墩果酸、兒茶酸、谷甾醇等多種人體生命活性物質和人體生長發育必需的微量元素。人們對金櫻子的研究主要集中在藥效、制劑等方面，并且研究得不深入。金櫻子化學成分復雜，人們對其藥理作用及其他成分的研究還較淺。現代藥理研究證明:金櫻子煎煮液針對于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌及流感病毒有著較強的抑菌作用或抗病毒作用;金櫻子果實是有極大開發利用價值的第三代野生水果，既是一種良好的天然綠色食品，同時也可作為保健食品的基料，具有很大的開發價值。總之，金櫻子具有很大的潛在價值，這還需要我們不斷的深入研究，相信通過對金櫻子進一步的研究，它將會發揮更大的作用。

超聲提取的方法與其他實驗方法相比，具有縮短實驗提取時間、降低提取溫度、提高實驗提取效率、便于產品的純化、對提取物的結構和理化性質無影響等優點，因此，本研究選取超聲法提取金櫻子。選擇甲醇、丙酮、60%乙醇作為提取溶劑的原因，是因為實驗室內部經過長期對抗病毒藥物的篩選，發現這幾種溶劑提取物抗病毒效果普遍較好。

實驗研究表明，金櫻子60%乙醇超聲提取物抗病毒效果較好，乙醇作為一種提取溶劑，可將中藥的大學部分成分(如苷類、多糖、鞣質、有機酸鹽、蛋白質、酶和少量揮發油)不同程度的提取出來，且極性比甲醇、丙酮大。但其抗病毒物質基礎尚不明確，應對其進一步研究。