優選缺血/再灌注損傷模型的建立條件

蔡 琳

(徐州生物工程職業技術學院，江蘇徐州 221006)

1 實驗材料

1．1 藥材與試劑

四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，DMEM/F12培養基，胰蛋白酶，膠原酶，5－溴－2－脫氧尿嘧啶核苷(5－BRDU)，胎牛血清(FBCS)，青霉素，鏈霉素。

1．2 儀器與設備

CO2培養箱，生物潔凈工作臺，倒置相差顯微鏡，Milli－Q超純水處理裝置，酶標儀，不銹鋼正壓濾器，旋轉蒸發儀，循環水式真空泵，恒溫水浴鍋，電子天平:，真空干燥箱，血球計數板，96孔無菌培養板，200目細胞篩。

手術器械:手術刀、手術剪、鑷子、5 mL無菌注射器、1 mL無菌注射器、50 mL滅菌錐形瓶、碘酒、75%酒精。

2 實驗過程與結果

2．1 連二亞硫酸鈉(Na2 S2 O4)誘導心肌細胞缺血/再灌注損傷模型的建立

將細胞按照5．0×105個/mL接種于96孔板上，置于37℃，5%CO2培養箱中培養72 h作為實驗細胞。實驗分為①正常對照組:正常的高糖培養液培養;②低糖培養液組;③Na2S2O4模型組:同一板上不同列加入濃度分別為800、400、200、100、50μmol/L的Na2S2O4溶液+低糖培養液組作用1 h后，換成正常的高糖培養液繼續培養。根據MTT法檢測吸光度值A492，計算細胞活力，以確定最佳損傷濃度［1］。

2．2 MTT法藥效檢測

2．2．1 實驗原理

MTT法是檢測細胞增值的經典方法，可間接反映細胞的數目。活細胞線粒體中含有脫氫酶，脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶狀甲瓚(Formazan)顆粒，沉淀在細胞細胞內和細胞周圍，而死細胞無此功能。在一定細胞濃度范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞的數目成正比。用二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶標儀檢測其光密度值大小可以用Formazan的多少，間接反映細胞數量，即反映細胞的活力。

2．2．2 具體方法

取培養2～3 d，處于對數生長期、生長狀態良好的細胞96孔培養板，每孔100μL，繼續培養約12 h待細胞貼壁完全。設加藥試驗孔、空白對照孔(加細胞，但不加藥物)和空白調零孔(只加培養基，酶標儀調零用)，每組設5個復孔。繼續培養48 h，每孔加20μL(5 mg/mL)MTT，繼續培養4 h后吸凈孔內上清液，每孔加入150μLDMSO。在微量振蕩器上振搖10 min使紫色結晶溶解。用酶標儀在492 nm處掃描，測定吸光值(OD);計算細胞存活率和損傷抑制率［2］。

細胞存活率=OD實驗/OD對照×100%。

2．2．3 實驗數據的處理

實驗數據用X(－)±S表示。P＜0．05或P＜0．01提示有異顯著差或高度顯著性水平。采用SPSS16．0統計軟件進行處理，組間比較用單因素方差和LSD檢驗分析。

2．3 實驗結果

2．3．1 存活心肌細胞確認

倒置顯微鏡下，胰蛋白酶與膠原酶Ⅰ的混合溶液消化后的心肌細胞呈圓形，懸浮。臺盼藍計數示心肌細胞存活率達96%。4 h后開始逐漸貼壁，高度折光，初為放射狀的圓形，后為梭形，細胞在瓶壁逐漸展開、伸出偽足，似島嶼狀，變為三角形、多邊形等不規則的形態。24 h后可見細胞陸續伸出偽足。細胞團最先開始搏動，隨后，可見單個細胞開始搏動，搏動頻率各異，多在50～120次/min次左右。48 h大部分細胞都伸出偽足，形成不規則的星形，同步搏動頻率為60～90次/min［3－4］。

2．3．2 Na2S2O4損傷濃度與細胞存活率的關系

取接種完成的96孔板，隨機分成6組，①正常對照組:不進行任何處理，只加相應體積的DMEM/F12培養液，溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規培養;②缺血/再灌注性損傷模型組:分別加入800、400、200、100、50 μmol/L 的 Na2S2O4溶液，在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規培養1 h后，換成正常的DMEM/F12培養液，繼續在在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規培養［5－6］。MTT法檢驗結果見表1與圖1。

表1 Na2 S2O4損傷濃度與細胞存活率的關系

圖1 Na2 S2 O4損傷濃度與細胞存活率的關系

以正常對照組心肌細胞的吸光度值作為對照，對不同濃度Na2S2O4損傷模型組心肌細胞進行活力測定。結果顯示，各濃度 Na2S2O4(800、400、200、100、50 μmol/L)損傷組心肌細胞的活力均有所下降，與正常濃度組比較均有顯著性差異(P＜0．05)，且Na2S2O4對心肌細胞的損傷效應呈劑量依賴性，隨濃度增加，逐漸出現細胞功能改變，凋亡甚至死亡。根據文獻報道，低濃度的Na2S2O4主要造成心肌細胞的氧化損傷，而高濃度的心肌細胞造成缺血/再灌注損傷。綜合上述實驗結果，參照文獻，本實驗采用選擇400μmol/L的Na2S2O4損傷1 h建立心肌細胞的缺血/再灌注損傷模型［7－8］。

2．3．3 Na2S2O4損傷時間與細胞存活率的關系

表2 Na2 S2 O4損傷時間與細胞存活率的關系

圖2 Na2 S2O4損傷時間與細胞存活率的關系

取接種完成的96孔板，隨機分成6組，①正常對照組:不進行任何處理，只加相應體積的DMEM/F12培養液，溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規培養;②缺血/再灌注性損傷模型組:分別加入400μmol/L的Na2S2O4溶液，在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下分別常規培養 0．5、1、2、4、8 h 后，換成正常的DMEM/F12培養液，繼續在在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規培養。MTT法檢驗:結果見表2，圖2。

以上實驗結果可知，隨著損傷劑作用時間的延長，細胞的存活率明顯下降，為使實驗以滿足冠心病的心肌損傷的實際要求，且更加具有可信性，本實驗選擇存活率在50%左右劑量為最佳的劑量，因此選擇濃度為400μmol/L的Na2S2O4損傷心肌細胞1 h作為心肌細胞缺血/再灌注性損傷的最佳劑量。

3 小結

低濃度的Na2S2O4主要造成心肌細胞的氧化損傷，而高濃度的心肌細胞造成缺血/再灌注損傷。隨著損傷劑作用時間的延長，細胞的存活率明顯下降，為使實驗以滿足冠心病的心肌損傷的實際要求，且更加具有可信性，本實驗選擇選擇濃度為400μmol/L的Na2S2O4損傷心肌細胞1 h作為心肌細胞缺血/再灌注性損傷的最佳劑量。