深層過濾在非達霉素粗品提煉工藝中的改進應用

馬盛男，周陳鋒，*，張軍偉，陳輔辰，謝 廳，魯 寧

(1．杭州中美華東制藥有限公司 702車間，浙江 杭州 310011；2．杭州泉鑫化工有限公司，浙江 杭州 310021)

非達霉素(Fidaxomicin)是一種十八元大環內酯類抗生素，由德干高原游動放線菌(Actinoplans deccanensis)或桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)發酵產生。由Optimer公司研發的非達霉素于2011年5月27日獲FDA批準。其作用機理新穎，主要是通過抑制細菌的RNA聚合酶而產生迅速的抗難治梭狀芽孢桿菌感染(CDI)作用。其治療CDI優于現有藥物[1-2]。分子量1058.04，分子式C52H74C12O18，在體內可生成仍具活性的代謝物OP-1118，結構式如下：

圖1 非達霉素結構式Fig.1 Formula of Phydamycin

目前非達霉素主要由發酵法得到，經過固液分離后得到粗品，然后經過活性炭吸附、層析、結晶、制備、精制等手段得到最終產品[3]。提煉工段是該類產品的關鍵工藝，提煉除雜的效果直接決定結晶效果，當發酵液效價不高、雜菌較多或提煉不徹底時，產品中會有色素、大分子蛋白、菌渣等存在，會直接影響結晶效果，甚至無法結晶，或者結晶后無法過濾[4]。結晶是否順利實現，直接決定制備分離效果，而制備工藝直接決定了成品的質量，因此，提煉工藝就成了限制該類產品開發的關鍵。

我司目前采用發酵法得到高效價的非達霉素產品，當發酵水平不穩定時，容易出現粗提效果不佳的情況，導致結晶困難，產品顏色偏深，晶型不好，過濾困難，因此，我們尋找新穎的提煉技術，希望能夠快速、簡捷地除去一些雜質，從而不影響結晶效果。

深層過濾技術在生物制藥領域逐漸發展[5]，3M公司使用一種新的活性炭吸附優化技術，采用Zeta Plus濾材，經過特殊工藝制成漸緊結構(Graded Density)，使其濾材上層孔徑相對疏松，下層孔徑隨著縱向深度擴展而愈漸緊密，由此大的雜質顆粒可被阻擋在表面，而小的顆粒雜質隨其粒徑大小不同，被攔截在濾材縱向不同梯度上，從而保證了穩定的流速和極大的容污能力。與傳統過濾介質相比，具有過濾量大，吸附效果好的有點；與傳統的活性炭吸附相比，避免了使操作者暴露于大量粉塵中的缺陷，同時，使得放大生產時，操作更加便利、吸附效果更加穩定、廢渣處理更加簡捷。

圖2 深層過濾裝置Fig.2 Deep filtration plan

非達霉素發酵液經過固液分離等粗提手段后，得到含有高效價的、純度為50%左右的非達霉素乙酸乙酯溶液，以之為起始原料，選用適合抗生素的AC-R55SP型濾材和相應夾具(直徑17mm)，取1L原料(記為A)進行深層過濾，用蠕動泵調節過濾流速，每隔200mL接收濾液，共接收5瓶，按先后順序分別編號為B～F分別進行檢測，并進行結晶實驗。實驗結果如下。

表1 深層過濾結果對比Table 1 Comparison after deep filtration

從實驗中可以看到，過濾前呈棕色渾濁的樣品，經過過濾后，溶液顏色明顯變澄清，尤其是過濾后前400 mL樣品(編號B和C)，顏色改觀顯著。同時，B和C往下做結晶時，粗品的純度更高，達到76.8%，而不通過過濾的原料的結晶后純度只有65.4%。B的結晶粗品的檢測圖譜如圖3所示。

圖3 過濾液B的結晶粗品HPLC圖

Fig.3 HPLC of filtrate B

從HPLC檢測中可發現，B～F雖然顏色較原料澄清很多，但是其濾液的純度與原料相差無幾，這是因為濾膜主要過濾掉的成分是粗提液中的色素和大分子蛋白，其減少無法在HPLC上體現出來。而經過過濾后的樣品的結晶效果普遍優于原料，是因為原料中的色素和大分子蛋白會對結晶溶劑體系有較大影響。我們在操作中發現，越是靠前的過濾液，其析晶過程更加清晰，粗品的晶型和顏色也更好，過濾更快。

值得一提的是，由于吸附容量的緣故，該濾材只對少量原料有吸附效果，無法處理更多量。而我司非達霉素在生產過程中，往往需要處理上千噸級的原料，因此，深層過濾的應用和成本受到較大的限制。同時，吸附雜質類型和吸附損失也需要進一步的研究。我們期待著深層過濾技術的發展，開發出更大規格、成本更低的濾材，以適合非達霉素等發酵產品的提煉工藝。