葉底珠抑菌活性內生真菌的篩選及鑒定

趙名君，李俊南，曹 森，孫總政，高 天，杜 文,，孫景寬，于 江，伊夢潔，陳萬浩

(1.濱州學院 生物與環境工程學院，山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256600；2.濱州學院 山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室，山東 濱州 256600；3.貴陽中醫學院 基礎醫學院，貴州 貴陽 550000)

葉底珠(Securinegasuffruticosa(Pall.) Rehd)為大戟科葉底珠屬植物，別名一葉荻、狗杏條、黃恨子、懶漢菜等[1]。葉底珠高莖叢生，多分枝，是能夠在干旱荒漠區生長，耐干旱貧瘠的一種重要固沙灌木[2]。葉底珠富含一葉萩型生物堿類化合物、黃酮、蘆丁、鞣質、酚類化合物及多種氨基酸等有效化學成分[3-4]。葉底珠通常根部入藥，具有活血舒筋、健脾益腎、祛風活血等功效，用于治療風濕腰痛、四肢麻木和小兒疳積等疾病[2，5]，對神經衰弱、面部神經麻痹、小兒麻痹后遺癥、眩暈、耳聾、神經衰弱、嗜睡癥、陽痿、急性肝損傷等疾病也有一定的療效[4，6-10]。葉底珠具有很好的開發與應用價值，市場的需求量高。為了保護野生資源，尋找能產生葉底珠活性物質和藥理活性相似的內生真菌是一個值得研究的方法。

植物內生真菌是指存在于植物體內，但不引起植物病害的一類真菌[11]。內生真菌與宿主植物具有非常復雜的關系，它能夠產生促進植物生長的營養和激素，也能夠產生幫助宿主抵御病害的物質，還能夠產生眾多的藥用活性組分以及多種具有生物活性的產物等[11-12]。內生真菌分布廣泛，種類豐富，據統計真菌的新型天然產物約一半來源于內生真菌[13]，其中包括大量的具有抗菌活性的天然化合物[14-15]。目前，對葉底珠內生真菌抗真菌細菌活性的研究國內外尚未見報道。本課題組采集了葉底珠，對其根部、莖部和葉部的內生真菌進行了分離純化，此外利用8種病原菌為指示劑，對其抗菌活性進行了初步研究，并結合形態學和分子生物學手段，對具有抑菌活性的內生真菌的分類地位進行了鑒定，為進一步尋找抗菌活性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葉底珠Securinegasuffruticosa(Pall.) Rehd 健康植株采自黃河三角洲貝殼堤島，經濱州學院夏江寶教授鑒定。供試病原菌：金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus，大腸埃希菌Escherichiacoli， 銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa，糞腸球菌Enterococcusfaecalis，白色念珠菌Candidaalbicans，小麥赤霉病菌Fusariumgraminerum，立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，辣椒炭疽病菌Colletotrichumcapsici由濱州學院生物制藥教研室和貴州大學生化營養研究所提供。DNA 提取試劑盒、2×Pfu PCR 預混液、DNA-Marker、引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3') 購于生工生物工程(上海)股份有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 內生真菌分離與純化

采集新鮮健康的葉底珠完整植株，用無菌水沖洗干凈，置于濾紙上自然風干，去腐葉。分別將葉底珠的根、莖、葉等切成約0.5 cm的小段，置于無菌的培養皿中。按下列程序進行表面消毒[15]：75%乙醇漂洗約3 min，無菌水沖洗5次，0.1%升汞消毒約3 min，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸取多余水分，無菌刀片將材料切成0.2 cm×0.2 cm 的小塊段。將上述組織塊分別置于加有青霉素和鏈霉素的PDA培養基中，每皿3塊，26 ℃恒溫培養，同時將上述經表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于PDA 培養基中，26 ℃培養，檢查表面消毒是否徹底。培養3～10 d后及時采用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA培養基上進行純化，純化后轉接到斜面上保存備用。

1.3 抑菌實驗

挑取經活化的內生真菌菌絲或孢子接種于PDA 液體培養基中，于26 ℃、120 r/min 培養7 d；5 000 r/min 離心20 min，收集菌絲體和發酵液。菌絲體先經超聲破碎，再把經95%乙醇浸提24 h后減壓濃縮成醇浸膏，用適量無菌水45 ℃溫浸，充分混勻制成菌體待測溶液。發酵液未經濃縮直接進行抑菌實驗。采用濾紙片擴散法：將約 1×108cfu/mL指示細菌菌液(或真菌的孢子)涂布于牛肉膏蛋白胨平板(或PDA培養基，白色念珠菌采用沙氏培養基)，在適當位置貼上己滅菌的濾紙片(Φ=6 mm)，然后分別吸取發酵液和菌體待測溶液20 μL 置于濾紙片上，無菌水做對照，每個樣品重復3 次。細菌在37 ℃培養16～24 h，白色念珠菌在28 ℃培養36～48 h，其他真菌在28 ℃恒溫培養96～108h， 觀察菌體生長情況，并測量抑菌圈直徑。

1.4 內生真菌的鑒定

形態鑒定:用接種針挑取少量菌絲點植在查氏培養基的平板的中心位置，然后于28 ℃ 培養7或14 d進行觀察。觀察菌落顏色、大小、菌落紋飾、質地、邊緣;分生孢子形態及大小[16]。

分子鑒定：取內生真菌發酵后離心，取菌絲冷凍干燥。取100mg 菌絲于2 mL EP 管內按照DNA 提取試劑盒說明書的步驟采用CTAB 法提取內生真菌DNA。按照25μL體系，加入12.5μL 2×Pfu PCR Mix，0.5μL ITS1，0.5μL ITS4，1.5μL DNA， 10μL超純水。以ITS1 和ITS4 進行PCR 反應，95 ℃、5 min，95℃、45 s，52 ℃、30 s，72 ℃、3 min，35 個循環，72 ℃、15 min 擴增ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列。對PCR 反應產物利用1%的凝膠于120 V 電泳30 min，根據Marker 判斷是否存在400～800 bp 大小片段。對于成功擴增目的片段的樣品送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行電泳切膠純化測序。根據測序結果，在GenBank 數據庫中進行BLAST 比對，搜索同源序列。盡量選取有代表性菌株序列作進一步的分析。首先采用Clustal X 1.81 將序列對齊，利用MEGA 5.2 軟件進行系統發育分析，并以自展法進行檢測，共循環1 000次，構建鄰接樹。將菌株D11和G11的ITS 序列提交至GenBank 數據庫，登錄號為 MG548565，MG548557。

采用分離率(isolation rate，IR)定量描述葉底珠內生真菌各菌株在葉底珠組織中的豐富度、分布偏好性、組成結構。分離率是分離獲得的菌株數與分離的組織塊數的比率，以百分率表示[17]。

2 結果與分析

2.1 葉底珠內生真菌的分離與培養

采用組織塊法從3株葉底珠的根、莖和葉中共分離得到21、12、8株內生真菌(表1)，分離率分別為58.33%、48.00%、47.13%，平均分離率為47.98%。可見葉底珠根部內生真菌的數量明顯多于葉部內生真菌，表明內生真菌的分布具有組織偏好性。此外，空白對照培養基上未長出菌落，說明無環境污染，并且接觸表面消毒后材料表面的培養基上也無菌落長出，說明消毒完全，表明所得菌株為來自植物體內真菌。

表1 葉底珠的根莖葉組織內生真菌分離菌株數和分離率Table 1 Isolation rate of endophytic fungi from roots,stems and leaves of S.suffruticosa species or varieties

通過在PDA培養基上培養7天后，觀察各內生真菌的菌落形態和顯微結構可以看出，葉底珠的內生真菌在生長速度、菌落形態和顯微結構上存在較多差異，具有較為豐富的形態多樣性，表明分離到菌株的多樣性和其分類地位的不同。而且產色素方面也存在較多差異，有產乳白色、深褐色、紫紅色、棕黃色等，而部分真菌僅為白色。有部分真菌觀察生長有孢子囊和孢子，大部分真菌未觀察到孢子，可能為不產孢真菌，可能與培養條件有關。

2.2 葉底珠內生真菌抗菌活性

表2 葉底珠內生真菌對的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of fungal endophytes isolated from S.suffruticosa

用分離到的41株內生真菌進行抑菌試驗，其中有2株菌G1和D1的菌體待測溶液和發酵液對白色念珠菌的抑菌效果都比較明顯，抑菌圈直徑達到15 mm以上。又進一步將G1和D1的菌體待測溶液和發酵液，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌，小麥赤霉病菌、立枯絲核菌和辣椒炭疽病菌作為指示菌，進行抗菌活性測定，結果顯示內生真菌對多種指示菌具有明顯抑制作用，表現出顯著的抑菌廣泛性，而且菌體待測溶液的效果好于發酵液，內生真菌G2和D1對細菌的抑制效果好于真菌。由表2可見，內生真菌菌株G11對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和小麥赤霉病菌的抑菌圈直徑大于20 mm，菌株D11對大腸埃希菌和小麥赤霉病菌的抑菌圈直徑大于20 mm，表現出相對較強的抑制活性，值得進一步研究。

判斷標準：抑菌圈直徑<10 mm為低敏，10～14 mm 為中敏，15～19 mm 為高敏，>20 mm 為極敏[18]。

2.3 內生真菌的鑒定

菌株G11分離自葉底珠的根。查氏固體培養基上菌落橢圓形，周圍為白色菌絲，邊緣整齊，背面呈淺黃色；菌絲有隔；查氏培養基上未見產孢結構。菌株D11分離自葉底珠的葉。查氏培養基培養菌落近圓形，顏色先由白色變成棕黃色，邊緣不整齊，背面呈黃色；菌絲有隔；孢子呈圓形或橢圓形，棕黑色；有剛毛結構。

再采用Mega 5.2軟件，用Neighbor-Joining(NJ) 法建立系統發育樹的分析觀察表明，通過分離篩選得到的菌株G11，與GenBank上下載的多株球毛殼菌Chaetomiumglobosum能很好地聚在一個進化分枝中，見圖1，并有99%的支持率，結合培養特征，確定其為毛殼屬的球毛殼菌Chaetomiumglobosum。菌株D11與GenBank上下載的多株枝細枝孢菌Cladosporiumramotenellum能很好地聚在一個進化分枝中，見圖1，并有100%的支持率，結合培養特征，確定其為枝孢屬的枝細枝孢菌Cladosporiumramotenellum。

圖1 系統發育樹

3 討論

內生真菌廣泛存在于植物體內，其種類和數量與宿主植物種類、部位、生長狀況，自然環境等密切相關。內生真菌對寄主具有一定的偏好性，寄主植物種類是決定內生真菌種群結構的重要因素之一，如座囊菌綱的格孢菌目是草本植物中較為普遍的內生真菌[19-20]。

本研究表明，從葉底珠根莖葉組織中分離獲得了41株內生真菌，并具有多種的形態和活性特征，可見其內生真菌的數量多種類非常豐富。本課題組還研究發現葉底珠內生真菌中，毛殼屬Chaetomium是葉底珠的優勢屬(未發表)，而且在根、莖、葉中均有分布。毛殼屬的菌株是常見的植物內生真菌，在棗樹[21]和枸杞[22]等植物的內生真菌中也發現了毛殼屬是優勢屬，在銀杏[23]、溫郁金[24]、玉米[25]甚至深海沉積物樣品[26]中，都分離到過毛殼屬的菌株，部分毛殼屬的菌株還具有多種活性成分，常作為生防菌對植物病原菌具有很好的防治效果。傳統藥用植物白茅Imperatacylindrical中分離獲得的一株內生菌球毛殼菌C.globosum能產生結構新穎和藥理活性顯著的化學成[27]。在側柏內生真菌球毛殼菌C.globosumZH-32 的次生代謝物中分離鑒定出球毛殼菌素A，發現其對多種病原細菌及農業上危害嚴重的植物病原真菌具有強烈的抑制作用[28]。發現藥用植物三七的內生菌C.globosum的代謝產物能抑制植物病原菌生長，具有抗氧化活性，還可以抑制乙酰膽堿酯酶[29]。枝孢屬Cladosporium的菌株也是廣泛存在于植物中的內生真菌，在越南槐、月季、康乃馨、玫瑰、山茶花和鳳凰木中是優勢菌群[30-31]，在角果木[32]、山蒼子[33]、蒜頭果[34]等植物中都有發現，研究還發現角果木內生真菌C.cladosporioidesJG-12的活性代謝產物能抗菌，抑制乙酰膽堿酯酶活性以及抑制全齒復活線蟲活性[32]。

本實驗分離到41株內生真菌，其中21株來自根部，其中具有最佳抑菌活性的2 株菌株分別是Chaetomium屬和Cladosporium屬的真菌，而且對多種指示菌具有抑制作用，表現出廣泛的抑菌性，所以內生真菌ChaetomiumglobosumG11和CladosporiumramotenellumD11的活性代謝產物有待分析、分離，將在新型抗菌、抗腫瘤、治療神經衰弱藥物的篩選方面具有較好的研究價值。內生真菌與植物長期共生，在一定程度上影響植物的生長發育，本研究發現內生真菌對植物病原真菌也具有一定的作用效果，表明內生真菌在提高藥用植物培養繁殖，進行規模化生產上，具有良好的開發應用前景。