N-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺葡萄糖醛酸苷的高效制備

孔水仙,白洪越,王 宇,侯熙彥,呂 俠

(1. 大連民族大學生命科學學院,生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；2. 大連醫科大學附屬第二醫院 遼寧 大連 116027 )

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(Uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferase,UGTs)是一種重要的II相代謝酶，介導各類葡萄糖醛酸結合反應[1]。UGTs酶活性升高、降低及活性消失，無疑會直接導致UGTs參與代謝清除為主的物質在人體內的血漿藥物濃度降低或升高，進而導致藥效的缺失/減少或毒性作用的產生。N-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺(NBHN)能夠被UGTs酶廣泛快速代謝，生成單一的代謝產物N-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺葡萄糖醛酸苷(NBHNG)，該產物具有較好的熒光屬性，使得NBHN能夠作為UGTs酶廣譜熒光探針底物，進行各個亞型UGTs酶活性的同時檢測[2]。再者NBHNG也被作為探針底物用于β-葡萄糖醛酸苷酶的活性檢測[3]。本文首先考察了不同種屬動物肝微粒體催化NBHN發生葡萄糖醛酸化反應的轉化效率,篩選出能夠高效轉化NBHN的酶源。 同時,應用固相陰離子交換柱實現了目標產物的特異性收集、高效分離及純化，并對其結構進行了表征，獲得了純度大于95%的NBHN葡萄糖醛酸苷產物單體。

1 實驗部分

1.1 試劑

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸鈉鹽(UDPGA)、聚氧乙烯十六烷基醚(Brij58)、MgCl2和三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購自Sigma公司; 人肝微粒體(HLM)、食蟹猴肝微粒體(CyLM)、大鼠肝微粒體(RLM)、小鼠肝微粒體(MLM)、豚鼠肝微粒體(GLM)、比格狗肝微粒體(DLM)、豬肝微粒體(PLM)、牛肝微粒體(BLM)和兔肝微粒體(RaLM)均購自瑞德肝臟疾病研究有限公司;C18WAX 陰離子交換固相色譜柱購自大連思譜有限公司。

1.2 實驗過程

1.2.1 NBHNG的制備與鑒定

在UGTs反應體系中依次加入猴肝微粒體(0.5 mg/mL)，NBHN(500 μmol/L),Tris-HCl(50 mmol/L),及MgCl2(50 mmol/L)，再加入UDPGA(40 mmol/L)起始反應。37 ℃下孵育 5 h 后,在上述反應體系中加入乙腈終止反應,于高速冷凍離心機中離心20 min(4℃，20，000×g)。取上清液于UPLC-UV-ESI-MS分析NBHN生成NBHN葡萄糖醛酸苷產物的轉化率。混合液加入C18WAX固相萃取柱進行富集、分離和純化。采用UPLC-UV-MS對洗脫液中目標產物進行鑒定、監測及純度分析。含有NBHN葡萄糖醛酸苷的洗脫液經旋轉蒸發后即得單體目標產物。所得產物通過紫外，質譜和核磁共振進行結構表征。

1.2.2 NBHNG紫外光譜和熒光發射光譜的繪制

將目標產物配置成濃度為10μmol/L的Tris-HCl-乙腈混合液(1∶1)，分別吸取200 μL置于96孔透明酶標板和黑色酶標板中，用多功能酶標儀分別測定NBHN葡萄糖醛酸化產物的紫外吸收光譜(300～800 nm)和熒光發射光譜(400～800 nm)。

1.2.3 NBHNG標準曲線的繪制

首先，配制一系列不同濃度的NBHNG標準溶液(0,3.9,7.8,15.6,31.25,62.5,125,250,500,1000,2000,8,16,2500和3750 nmol/L),取各濃度標準溶液2 μL于pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中(200 μL)并加入等體積乙腈。然后，吸取200 μL置于96孔黑色酶標板中，使用多功能酶標儀測定NBHNG的熒光強度，激發波長和發射波長分別設置為362 nm和450 nm。最后，以NBHNG標準溶液濃度為橫坐標，NBHNG的熒光強度為縱坐標,繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 種屬差異實驗結果

9種動物肝微粒體催化NBHN發生葡萄糖醛酸化反應的高效液相色譜分析結果如圖 1(a)所示,當底物NBHN終濃度為500 μmol/ L，各種屬肝微粒體蛋白終濃度為0.5 mg/mL時，通過5h的孵育后，9種動物肝微粒體均能夠催化NBHN發生葡萄糖醛酸化反應，且轉化效率均超過50%。CyLM,RLM,MLM,GPLM,PLM,DLM,RaLM,BLM和HLM的轉化率分別為97.6%,70.6%,72.0%,89.1%,86.9%,78.1%,83.4%,93.9%和52.9%。結果如圖 1(b)所示,在正離子模式下掃描,其代謝產物準分子離子峰[M+H]+,m/z:446.15,表明該代謝產物的分子量為445.15,比底物NBHN的分子量增加了176,初步確定該產物為NBHN的單葡萄糖醛酸化產物。

2.2 NHBNG結構表征

NBHNG淺黃色粉末(乙腈)，紫外最大吸收波長為240 nm和360 nm，結合核磁共振氫譜和碳譜推測其分子式為C22H23NO9。從13C NMR 中發現，出現6個新的葡萄糖醛酸的碳信號(δ100.1,73.3,75.7,71.5,75.7,170.0)。從遠程相關譜圖HMBC譜中看到(δ5.40) 的葡萄糖醛酸的端基氫信號與C-4(δ157.8)有相關。1H NMR 中產物的葡萄糖醛酸特征信號端基質子 H(δ5.40,J=7.2Hz)偶合常數大于7,再次證實其為β構型糖苷鍵。因此,可確定NBHN在猴肝微粒體的催化下生成了NBHN-β-D-葡萄糖醛酸苷結合物。

2.3 NBHNG紫外光譜和熒光發射光譜的繪制

結果表明,NBHN在UGTs酶的催化作用下可生成具有較好熒光屬性的產物NBHNG. 通過在單位時間內檢測NBHNG熒光信號強度的變化,可實現復雜生物體系中多種UGTs亞型酶活性的高通量檢測及其各亞型UGTs酶抑制劑的快速篩選.

Fig.2 Absorption (a) and emission (b) spectrum of NBHNG

2.4 NBHNG標準曲線的繪制

借助多功能酶標儀熒光檢測法構建了NBHNG的標準曲線如圖 3所示,可見NBHNG在 0 ～3.75 μmol/ L 濃度范圍內其熒光強度與濃度呈線性關系,回歸方程為y=21.64x+700.8,R2=0.9997。NBHNG的標準曲線的繪制對于后續多種UGTs亞型酶活性的定量檢測、酶動力學實驗及各亞型UGTs酶抑制劑的抑制常數的測定具有重要意義。

Fig.3 Calibration curve of NBHNG

3 結論

本文利用猴肝微粒體能夠高效轉化NBHN生成NBHN的單葡萄糖醛酸苷(NBHNG)產物，實現了NBHNG的高效生物合成。同時，借助C18WAX固相萃取柱實現了NBHNG的特異性收集、高效分離及純化。該生物合成法轉化效率高、目標化合物純度高、產物后處理及制備過程較為簡單,為NBHNβ-D-葡萄糖醛酸苷的高效制備提供了新方法.