反膠束法提取小米中蛋白酶條件的優化

付莉媛,代旭棟,張宇輝,付 俐,郭凱林,張弘弛,劉 瑞

(山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009)

小米中的營養成分十分豐富，它不僅含有人體生長不可或缺的營養物質，而且還擁有一定的藥用價值[1]。但目前人們對小米蛋白酶的提取研究較少，本實驗采用反膠束提取法分離小米蛋白酶，旨在提高提取率，為后續對小米蛋白酶的研究提供參考。反膠束萃取法有著選擇性高、容易放大、萃取液可循環利用、分離和濃縮同步進行等優點，特別適用于酶蛋白的分離[2]。并且反膠團可以保護酶蛋白分子，所以使用反膠束萃取可以有效減少提取過程有機溶劑對酶蛋白分子的損傷。而且反膠束萃取技術與傳統的酶蛋白提取技術相比，它成本更低并且可以進行連續操作[3]。

1 材料

1.1 小米

小米,大同29號。

1.2 儀器與試劑

PHS-3C型pH計酸度計(上海儀電科技儀器股份有限公司)；XFB-200型小型粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)；UV-3200S型紫外/可見分光光度計(上海美國譜達儀器有限公司)；AXTGL16M型臺式高速冷凍離心機；JA5003B型千分之一電子天平(河南精密儀器儀表有限公司)。堿性蛋白酶(源葉生物，批號L19A6L1)；正辛烷、正己醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；氯化鉀；氫氧化鈉；鹽酸；所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 提取小米蛋白酶

適量粉碎后的小米粉于燒杯，按料液比1∶10(質量體積)加入蒸餾水，攪拌提取60 min。4000 r/min離心20 min，待離心完成后取上清液即小米蛋白酶粗提取液。

2.2 制備標準曲線

將堿性蛋白酶粉末用0.1 mol/L的KCl溶液(pH值標定為11)分別配制成濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的酶溶液，然后以0.1 mol/L的KCl溶液(標定pH值為11)為空白對照，使用紫外/可見分光光度計在258 nm處對所有濃度的堿性蛋白酶溶液進行掃描，測量其吸光度值。

2.3 單因素實驗

2.3.1 CTAB濃度(A)對提取效果的影響

將正辛烷與正己醇按照4∶1的比例配置成混合液，然后取適量CTAB粉末，配置成濃度為0.01，0.015，0.02，0.025，0.03 mol/L的反膠束溶液。小米蛋白酶粗提取液用濃度為0.10 mol/L的氯化鉀溶液(pH值標定為11)稀釋，得1.0 g/L小米蛋白酶溶液。然后酶溶液分別與上述不同CTAB濃度的反膠束溶液以1∶1的比例混合，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。待振蕩結束后將濁液轉移到50 mL離心管中，配平后3000 r/min離心4 min，然后取下相液，在258 nm波長下測量各樣品的吸光度值。

2.3.2 正辛烷與正己醇的配比(B)對提取效果的影響

將正辛烷與正己醇分別按照以下比例配置成混合液：3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1。取適量CTAB粉末，用不同配比的有機溶劑混合液分別配置成0.020 mol/L的反膠束溶液。小米蛋白酶溶液分別與有機溶劑配比不同的反膠束溶液以1∶1的體積比進行混合，后續步驟同上。

2.3.3 氯化鉀溶液濃度(C)對提取效果的影響

用天平精確稱取適量氯化鉀晶體并用蒸餾水將其分別配置成濃度為0.05，0.075，0.10，0.125，0.15 mol/L的溶液(pH值標定為11)，然后用上述不同濃度的氯化鉀溶液將小米蛋白酶粗提取液稀釋為1.0 g/L蛋白酶溶液。將反膠束溶液與氯化鉀濃度不同的小米蛋白酶溶液混合，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。后續步驟同上。

2.3.4 小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的配比(D)對提取效果的影響

用天平精確稱取適量氯化鉀晶體并用蒸餾水配置成濃度為0.10 mol/L的氯化鉀溶液(pH值標定為11)，并用其稀釋小米蛋白酶粗提取液，得到1.0g /L蛋白酶溶液。將反膠束相溶液與蛋白酶溶液分別按照不同的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)混合(混合液體積固定)，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。后續步驟同上。

2.5 正交實驗

根據單因素實驗的結果，然后進行L9(34)正交試驗，水平設置見表1，正交實驗設計見表2。

表2 正交實驗設計表Table 2 Orthogonal experimental designTable

3 結果與分析

3.1 標準曲線

使用origin軟件對結果進行分析并得到標準曲線見圖1，以及回歸方程為Y=1.66189x+0.03052，(R=0.99812)，其中x為濃度(g/L)，Y為吸光度值。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

3.2 單因素實驗結果與分析

3.2.1 CTAB濃度對提取效果的影響

不同濃度的CTAB對提取小米蛋白酶的效果的影響見圖2，從圖2可以得知隨著CTAB的濃度逐漸升高，提取液在258 nm處的吸光度值也逐漸升高，當吸光度值達到最大(1.913)時，CTAB的濃度為0.025 mol/L。當濃度再增加時，吸光度迅速下降。當CTAB濃度在一個比較低的范圍內時，隨著CTAB濃度的增大，反膠束體系中反膠團的形成也會增多，因而增溶酶蛋白的能力也會增強[4]。但是，CTAB的濃度不能太高，否則就會對酶蛋白的萃取效果造成不良影響。因為含水率在水相體積不變的情況下，會隨著CTAB濃度的增大而減小，反膠團的大小也隨之減小，當反膠團小于酶蛋白分子時，酶蛋白就不能進入到反膠團中[5]，因而當濃度超過0.025 mol/L時，吸光度會下降。根據以上分析最終選取CTAB的濃度為0.025 mol/L。

圖2 CTAB濃度對提取效果的影響Fig.1 Effect of CTAB concentration on extraction

圖3 正辛烷-正己醇對提取效果的影響Fig.3 Effect of n-octane-n-hexyl alcohol on extraction

3.2.2 正辛烷與正己醇的配比對提取效果的影響

正辛烷與正己醇的不同配比對小米蛋白酶提取效果的影響見圖3，從圖3中可以看出當正己醇的含量逐漸升高時吸光度也在逐漸升高，并且在比例為3.5∶1時達到最大(1.099)。但是，當比例小于3.5∶1，即正己醇含量更加高時吸光度值迅速減小。正己醇能夠插入到CTAB分子之間，從而減弱CTAB分子之間的內聚力，增大了其在有機溶劑中的溶解度，促進了反膠束相的形成。但是，當正己醇含量太高時，反膠團表面上正己醇所占的比例過大，導致CTAB極性頭之間的靜電斥力減弱，反膠團的尺寸減小，形成空間位阻，以致無法包裹酶蛋白分子，使得萃取效果減弱[6]。綜上結果選取正辛烷-正己醇混合液比例為3.5∶1。

3.2.3 氯化鉀溶液濃度對提取效果的影響

不同濃度的KCl溶液對小米蛋白酶提取效果的影響見圖4，從圖4中可以看出當KCl濃度增至0.075 mol/L時吸光度值最大，為0.772。然后隨著KCl溶液的濃度逐漸增大，吸光度值慢慢減小，并且在0.15 mol/L時達到最小。當鉀離子濃度增大后，鉀離子就會大量向“水池”移動并且取代酶蛋白，使得酶蛋白分子從“水池”鹽析出來。鉀離子濃度增大，反膠團內表面的雙電層受到壓縮而變薄，使得酶蛋白與反膠團內表面之間的靜電吸引力減小，最終使萃取率降低。反膠團內表面的雙電層變薄后，也減弱了CTAB之間的相互斥力，導致反膠團的內徑變小，從而使酶蛋白分子不能進入反膠團中[7]。所以吸光度值會隨著KCl濃度的增大而逐漸減小，綜上所訴最后選取KCl溶液的濃度為0.075 mol/L。

3.2.4 小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的配比對提取效果的影響

小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的比例對小米蛋白酶提取效果的影響見圖5，由圖5可知，隨著比例的增大吸光度值在逐漸的減小，而當比例為1∶1時達到最小(1.038)，但是當小米蛋白酶溶液與反膠束溶液的比例超過1∶1時，吸光度值就會隨著比例的增大而逐漸增大。混合液中小米蛋白酶的含量會隨著小米蛋白酶溶液與萃取液配比的逐漸減小而減小。當小米蛋白酶溶液與萃取液混合后的體積一定時，隨著配比的逐漸減小，混合液中萃取液所占的比例漸漸增大。雖然混合液中小米蛋白酶的含量降低，但是反膠團的數量增多，所有反膠團中含有的小米蛋白酶總量也增大[8]。所以吸光度值也在增大。終合考慮選擇小米蛋白酶溶液與萃取液的比例為1∶2。

圖4 KCl濃度對提取效果的影響Fig.4 Effect of KCl concentration on extraction

圖5 小米蛋白酶溶液與萃取液的配比對提取效果的影響Fig.5 Effect of the ratio of protease solution and active solution on the extraction of millet

3.3 正交實驗結果與分析

正交實驗結果見表3，根據回歸方程計算出相應的酶含量并填入表3對應的空格內。然后使用“spss”電腦軟件對實驗結果進行方差分析，其中把極差最小的B項作為誤差項，主體間效應檢驗結果見表4。根據表3的結果我們可以知道Rd﹥Rc﹥Ra﹥Rb，即四個因素對反膠束萃取的影響順序為小米蛋白酶溶液與反膠束萃取液的比例﹥KCl濃度﹥CTAB濃度﹥正辛烷與正己醇的配比。根據表4中的方差分析結果可以發現因素A、C的Sig值都大于0.05，因素D的Sig值小于0.05，所以因素D對小米蛋白酶的提取效果有顯著性影響，因素A、C對小米蛋白酶的提取效果均無顯著性影響。綜合上文的所有分析，確定小米蛋白酶的最佳提取條件為A2B1C2D3，即CT AB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，KCl濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

3.4 驗證實驗結果與分析

根據正交實驗的最佳結果進行驗證實驗，并在258 nm波長處測量吸光度值，分別得到三個水平的結果為0.824 g/L，0.825 g/L，0.824 g/L，均值為0.8243 g/L，接近正交實驗的最佳結果，所以可以確定小米蛋白酶的最佳提取條件為CTAB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，氯化鉀濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

4 結論

本實驗以優化小米蛋白酶的反膠束提取條件為目的，對四個不同的提取條件進行單因素實驗，并將實驗結果繪制成折線圖，直觀分析結果；然后以單因素實驗結果為基礎進行L9(34)正交實驗，其中對四個單因素的三個水平分別設置為：CTAB濃度0.020 mol/L、0.025 mol/L、0.030 mol/L；正辛烷與正己醇比例3∶1、3.5∶1、4∶1；KCl濃度0.05 mol/L、0.075 mol/L、0.10 mol/L；小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例2∶1、1∶1、1∶2。最后對正交實驗的結果進行直觀分析和方差分析并得出最佳提取條件CTAB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，氯化鉀濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal experimental results

表4 正交實驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results