大連黑松松材線蟲的調查、分離與鑒定

王玨，李霜雯，呂曉亮，田宇明

(大連市現代農業發展服務中心,遼寧 大連 116023)

松材線蟲病(PWD)是由松材線蟲侵染引起，一段時間內可以使松樹枯死的一種嚴重森林病害，該病又稱為松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、松樹枯萎病，被稱為“松樹的癌癥”[1]，具有發病致死速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點，是嚴重威脅全世界林業生產的重大檢疫性病害之一[2]。松材線蟲病最早于1905年在日本九州長崎發現，于1982年首次在我國南京市中山陵黑松上發現[3]，于2016年在大連沙河口區大頂山發現。由于黑松是大連市南部風景林和沿海防護林的主要樹種，而黑松又是松材線蟲病的易感染樹種，疫情得不到良好的控制，將直接威脅大連市6.7萬hm2松林的安全。由于該病由松材線蟲引起，目前國內外尚無很好的根除方法，唯有通過早期診斷和檢測，設立和建設無病區，快速清理疫木以防疫情擴散[4]。松材線蟲的傳統檢測技術如形態學等方法在檢測過程或多或少存在一定的局限性[5]，分子檢測技術則具有快速、特異、靈敏的特點[6]，本研究首次對大連地區黑松枯萎病發病情況進行廣泛調查并對病原線蟲進行多方面鑒定，以期為松材線蟲病未來的防治提供相應依據。

1 材料和方法

1.1 調查地點及采樣方法

2017年10月到2018年3月，對遼寧省大連市黑松枯死的7個典型地區作為樣地進行調查(濱海路西段、動物園、中山青云林海、中山棒棰島、西崗捷山、沙河口大頂山、甘井子翡翠春城)，采用系統抽樣方法進行樣本的采集，每10～15 m確定一株枯死樹進行采樣。本次調查共采集494株黑松樣本，用于分離鑒定病原松材線蟲。測量記錄每株樣木的胸徑和樹高，采樣部位為樣木坡下方向距地1.3 m胸高處，采集量約80 g，裝入標本袋，及時將樣品冷藏待檢。

1.2 線蟲的分離

采用貝爾曼漏斗法[7]，將采集的木樣劈成長度小于1 cm，寬度小于0.5 cm的小木塊，每個樣品取樣7.5 g，重復3次，單層紙巾包好，純凈水浸泡12 h，漏取2 mL左右線蟲懸浮液放入離心管中，吸取管底線蟲液用于形態鑒定和分子生物學鑒定。分離過后的木塊、多余蒸餾水和漏斗進行120 ℃高溫無害化處理。

1.3 形態鑒定

用100 μL移液槍吸取離心管底部線蟲懸浮液滴至載玻片，解剖鏡下挑取雌、雄蟲各1頭以上，將其置于酒精燈火焰上方加熱3～5 s，線蟲加熱殺死后加蓋玻片，制成臨時玻片，于顯微鏡下觀察線蟲主要形態特征(口針、食道球、陰門、陰門蓋、交合刺、交合傘與尾端形態等)并進行初步鑒定。

1.4 分子生物學鑒定

用10 μL移液槍在顯微鏡下挑取形態無法確定的線蟲，從TAKARA公司購買DNA制備試劑盒，按照試劑盒要求步驟提取線蟲DNA，進行PCR擴增和測序。PCR擴增反應體系共50 μL，包括正反引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 35.75 μL，dNTP Mix 4 μL，dTaq酶0.25 μL，10×Taq Buffer 5 μL。松材線蟲特異性引物為東北林業大學松材線蟲實驗室贈送(上游引物：GATGGCGGTTCGATTCGCG,下游引物：TGGCTGGTCTCATCTGTCGG)。擴增程序為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min；采用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為130 V，電流為130 mA ，分析DNA片段的長度，觀察并照相。將PCR擴增產物送上海生化公司雙向測序。登錄NCBI網站中的BLAST頁面將測序結果與已登錄的序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 線蟲鑒定結果

2.1.1 形態觀察結果 成蟲頭部均具有明顯的溢縮，具口針和中食道球。雄蟲熱殺死后蟲體呈“J”形，強烈腹彎，側面觀呈爪狀，體前端與雌蟲相似，尾部有交合刺，尾端尖細，交合刺弓狀，成對，基頂高圓，喙突銳尖、交合刺遠端具小盤狀突，尾端腹面觀可見交合傘，多呈卵圓形，形態多變。雌蟲熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，成大寫的C形，唇區高，溢縮顯著，口針細長，基部略膨大，中食道球卵圓形，鱷梨狀，占體寬2/3左右，瓣門清晰，陰門位于蟲體中后部，大約體長70%處，陰門蓋明顯，像指甲形，附在陰門上，尾部指圓形，無尾尖突。

形態觀察結果表明，雌蟲和雄蟲的形態特征符合松材線蟲的鑒定特征，由于松材線蟲的雄蟲和擬松材線蟲的雄蟲形態很接近，因此辨認松木內松材線蟲的主要依據是雌蟲。

圖2 部分PCR凝膠電泳

2.1.2 分子鑒定結果 選擇松材線蟲序列特異性引物，以黑松疑似松材線蟲的DNA為模板進行PCR擴增和測序，獲得完全一致的序列,測序結果片段為105 bp。將序列在NCBI上比對結果顯示，黑松中分離的線蟲與松材線蟲多個登錄序列相似度為100%(如MK：292122.1)。綜上所述，以上分子測序結果結合樣地中黑松受害特征和松材線蟲特征，綜合判斷大連地區黑松枯萎病原線蟲為松材線蟲。

圖3 部分PCR產物序列結果

圖4 NCBI在線比對部分結果

2.2 松材線蟲調查結果

為全面了解大連地區松材線蟲病情況，本次調查涉及中山區、西崗區、沙河口區、甘井子區四個行政區，在各區具有代表性的地塊內選擇7個樣地，涉查面積合計約57.5 hm2。調查結果見表1。調查的枯死黑松數量為494株，通過形態觀察和分子生物學鑒定，其中有79株黑松有松材線蟲，每個地區線蟲檢出率差異較大，有松材線蟲株率平均為16.0%。

表1 各樣地黑松枯死調查結果

3 結論與討論

黑松較耐寒、耐干旱、耐瘠薄及對鹽堿土抗逆性較強，較抗海風，也可在海灘鹽土地方生長，耐海風和海剎，能與多種樹構成針闊混交林，在沿海造林總體表現較好。大連地區的黑松原產日本，從山東舟山群島引入到大連已有70多年歷史，經過幾十年的引種栽培，已形成了大連地區風景林和沿海防護林主林帶，為大連生態建設和林業發展起到了重要作用[8]。

調查明確了大連地區2017—2018年黑松感染松材線蟲的基本狀況，本次調查涉及大連各區具有代表性的地塊，通過形態觀察和分子生物學鑒定，結合樣地中黑松受害特征和松材線蟲特征，綜合判斷大連地區黑松枯萎病原線蟲為松材線蟲，在抽樣的黑松中感染率平均為16.0%。自2016年大連市在黑松上發現松材線蟲以來，已經造成上千畝松樹死亡，且尚無很好的根除方法，因此為防止大連市松材線蟲病疫情擴散，保障大連市森林生態安全，加強病害的早期診斷和檢測技術尤為重要[9]。針對松材線蟲病的防治還需在前期鑒定方法方面進行進一步研究，以期在未來檢測中縮短鑒定時間和簡化實驗方式。