凡納濱對蝦野田村病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

雷 燕，肖 洋，王 娟，張文文，胡芳源，唐紹林

（1.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司, 廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司, 廣東 廣州 510515）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是我國重要養(yǎng)殖蝦種，為世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦類之一[1]。然而隨對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的病害問題日益嚴重。近年來，“偷死病”[2-5]是困擾凡納濱對蝦養(yǎng)殖的主要病害之一，導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。2014年，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所科研人員通過組織病理學(xué)分析、人工感染實驗、疑似病原基因進化分析、病毒分離純化和熒光原位雜交等手段，證實新型野田村病毒（Litopenaeus vannamei nodavirus，LVNV）是導(dǎo)致凡納濱對蝦“偷死病”病原之一[6-7]。凡納濱對蝦野田村病毒隸屬于野田村病毒科（Nodaviridae）的 α野田村病毒屬（Alphanodavirus），是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新興病原體。感染野田村病毒的凡納濱對蝦臨床癥狀主要為肝胰腺萎縮和發(fā)白，空腸空胃，軟殼，生長緩慢，多數(shù)蝦腹部肌肉發(fā)白和壞死[7]。據(jù)調(diào)查，該病毒主要引起60 ～ 80 d的蝦發(fā)病，養(yǎng)殖環(huán)境較差的池塘死亡率高達80%[7]。

對于野田村病毒的傳染源、傳播途徑和感染方式尚無明確結(jié)論，亦無針對性治療方法。為及早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖凡納濱對蝦是否感染野田村病毒，及時對臨床發(fā)病病例進行針對性處理，有必要建立一種準確、快速、靈敏、特異的檢測方法。目前，針對水產(chǎn)動物病原檢測的方法有原位雜交、ELISA、膠體金試紙條、PCR及LAMP等，在實際檢測過程中，原位雜交和ELISA耗時長，靈敏度低；膠體金試紙條雖檢測快，但靈敏度偏低；LAMP則存在假陽性較高的情況。因PCR檢測方法有較高的特異性和敏感性，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物病原微生物的檢測和診斷。張達云等[8]建立了對蝦偷死野田村病毒的檢測方法，但尚未應(yīng)用于對臨床病料進行檢測。潘曉藝等[9]建立了羅氏沼蝦野田村病毒的 RT-PCR檢測方法，但該方法對凡納濱對蝦野田村病毒無特異性。筆者建立針對凡納濱對蝦野田村病毒的特異性RT-PCR檢測方法，為臨床對該病的準確診斷檢測提供一種快速、敏感、準確的技術(shù)手段，以盡早檢測，及時處理，減少損失。

1 材料和方法

1.1 材料

野田村病毒陽性材料采自福建省漳州市某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場，由廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司水產(chǎn)動物疾控中心實驗室（下稱“本實驗室”）收集、PCR擴增和測序鑒定并保存。健康凡納濱對蝦采自廣東省廣州市。白斑癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、對蝦桿狀病毒（Baculovirus penaei，BP）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、肝胰腺細小病毒（Hepatopancereatic parvovirus，HPV）、黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）、傳染性肌肉壞死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV）、桃拉病毒（Taura syndrome virus，TSV）陽性材料由本實驗室收集，并經(jīng)PCR擴增和測序鑒定，保存。凡納濱對蝦野田村病毒重組質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存。臨床樣品分別采自福建、廣東、海南、廣西、江蘇、浙江、山東等地凡納濱對蝦養(yǎng)殖場。

大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞、2×Taq PCR MasterMix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小量抽提試盒等購自天根生化科技（北京）有限公司，由本實驗室繁殖保存。pMD19-T載體、RNAiso Plus RNA提取試劑、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、DL2000 DNA分子標準購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中野田村病毒的基因序列（登錄號：KM112247）設(shè)計 1對特異性的引物序列。上游引物：5′ -TTGAAGGCTATCTCGTGACAG-3′；下游引物：5′ -ATTAGCTTCGTATTTGCTGGC-3′，預(yù)擴增片段長度為413 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 RNA的提取

取野田村病毒陽性凡納濱對蝦的鰓和肌肉組織，加入600 μL 滅菌雙蒸水，充分勻漿，于- 20 ℃冰箱凍融3次，以6 000 r/min低速離心，取上清液，用RNA抽提試劑RNAiso Plus提取上清液中的病毒RNA，所提RNA加入60 μL滅菌的焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解，保存于- 80 ℃下，備用。待檢凡納濱對蝦及健康凡納濱對蝦組織樣品也按照上述方法取樣，研磨處理后抽提RNA。

1.4 RT-PCR檢測及測序驗證

反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)體系（10 μL）：陽性樣品的病毒 RNA 模板 7 μL，5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃下保存，得cDNA產(chǎn)物。

擴增體系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix10 μL、滅菌雙蒸水 6 μL、cDNA 模板 3 μL 和 10 μmol/L上下游引物各 0.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min，95 ℃30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用12 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。用膠回收試劑盒純化目的條帶，與pMD19-T 載體于16 ℃下連接4 h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素（Amp+）的LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，從培養(yǎng)皿上挑取陽性重組質(zhì)粒菌落接種于 5 mL含 50 μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下震蕩培養(yǎng)12 ～14 h，用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒用F/R引物進行PCR 鑒定。重組質(zhì)粒送華大基因科技股份有限公司測序，結(jié)果提交NCBI 中的BLAST進行序列比對，利用DNAStar5.0、cluxtal X等生物信息學(xué)軟件進行序列分析。

1.5 RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

參考文獻[8-9]進行。通過調(diào)整 Taq酶濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、模板濃度、退火溫度、延伸時間等，對PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行優(yōu)化，以獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.6 RT-PCR特異性試驗

參考文獻[8-9]進行。分別提取健康蝦和野田村病毒陽性蝦、WSSV陽性蝦、IHHNV陽性蝦、BP陽性蝦、HPV陽性蝦、YHV陽性蝦、IMNV陽性蝦和TSV陽性蝦的核酸，作為模板，按照1.5中最優(yōu)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行 RT-PCR，觀察記錄反應(yīng)的特異性。

1.7 RT-PCR敏感性試驗

參考文獻[6-7]進行。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒的濃度進行測定后，按 10倍遞增稀釋成 1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL，再以各濃度梯度的質(zhì)粒作為反應(yīng)的模板，根據(jù)1.5中已獲得的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行PCR，反應(yīng)結(jié)束后取8 μL PCR產(chǎn)物用12 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，檢測所建立方法可檢出的最低模板量。

1.8 臨床樣品檢測試驗

應(yīng)用本研究建立的野田村病毒特異性 RT-PCR檢測方法，對收集自福建、廣東、海南、廣西、江蘇、浙江、山東等地的386份臨床樣品進行處理和RT-PCR檢測，檢驗新建立的 RT-PCR檢測方法的臨床實用性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測方法的建立

利用設(shè)計合成的針對于野田村病毒特異性引物，對野田村病毒陽性凡納濱對蝦樣品進行RT-PCR擴增，得到與目的條帶大小相符的特異性片段（圖1）。將PCR陽性產(chǎn)物分別回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序，得到一條長度為413 bp的基因序列，序列比對結(jié)果顯示，其與GenBank中獲得的野田村病毒基因的序列同源性為99.8%。

圖1 野田村病毒陽性凡納濱對蝦樣品的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR detection of nodavirus in positive Litopenaeus vannamei

2.2 RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

比較不同反應(yīng)體系和反應(yīng)程序下擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖2 ～ 5），圖2、3可見，Mg2+和引物用量對PCR反應(yīng)結(jié)果無影響，圖4、5可見，5 U/μL的 Taq酶使用量大于 0.5 μL時，退火溫度高于52.7 ℃時，PCR擴增結(jié)果一致，但為防止出現(xiàn)非特異性擴增，選擇 Taq酶使用量 0.5 μL，退火溫度58 ℃，因此，最終確定反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，滅菌雙蒸水 7 μL，cDNA 模板 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃條件下保存。

圖2 不同引物下PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification at different primer level

圖3 不同Mg2 +下PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification at different Mg2+ level

圖4 不同Taq酶下PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification at different Taq level

圖5 不同退火溫度下PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification at different annealing temperature

2.3 RT-PCR特異性試驗

分別提取健康蝦和野田村病毒陽性蝦、WSSV陽性蝦、IHHNV陽性蝦、BP陽性蝦、HPV陽性蝦、YHV陽性蝦、IMNV陽性蝦和TSV陽性蝦的核酸，作為模板，按照1.5中所獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行（RT-）PCR，對新建方法進行特異性分析，結(jié)果表明，僅野田村病毒陽性樣品可擴增出與試驗預(yù)期大小相符的目的條帶，健康蝦樣品及其他對照組樣品均未擴增出任何條帶（圖6）。

圖6 特異性擴增結(jié)果Fig.6 Result of specific amplification

2.4 RT-PCR敏感性試驗

對不同濃度的質(zhì)粒模板進行PCR擴增，檢驗新建方法的敏感性，結(jié)果表明，該RT-PCR檢測方法可檢出的最低質(zhì)粒模板濃度為100 fg/mL（圖7）。

圖7 敏感性試驗結(jié)果Fig.7 Result of sensitivity detection

2.5 臨床檢測結(jié)果

用建立的針對野田村病毒的特異性RT-PCR檢測方法，對386份采自福建、廣東、海南、廣西、江蘇、浙江、山東等地養(yǎng)殖場的臨床發(fā)病凡納濱對蝦樣品進行野田村病毒RT-PCR檢測，結(jié)果見表1。

表1 不同地區(qū)臨床凡納濱對蝦樣品野田村病毒的RT-PCR檢測結(jié)果Table 1 Detection results of nodavirus in clinical samples collected from different areas

3 討論

目前，世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)殖凡納濱對蝦的主要病原有白斑癥病毒（WSSV）、對蝦桿狀病毒（BP）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、肝胰腺細小病毒（HPV）、黃頭病毒（YHV）、傳染性肌肉壞死病毒（IMNV）、桃拉病毒（TSV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）和肝胰腺壞死性細菌（AHPND）等，為及時發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測這些病原體，均已建立針對性的快速檢測技術(shù)[10-14]。對于凡納濱對蝦野田村病毒，其危害嚴重程度、流行程度及傳播方式尚不清楚，亦無針對性的治療措施。

RT-PCR 檢測技術(shù)作為水產(chǎn)動物病原檢測的一種常規(guī)高靈敏的病原檢測手段，已應(yīng)用于許多病原微生物檢測。本研究參照GenBank中凡納濱對蝦野田村病毒的基因序列，設(shè)計合成了1對預(yù)擴增片段長為413 bp的特異性檢測引物，建立的針對凡納濱對蝦野田村病毒的特異性RT-PCR 檢測方法，可以從 100 fg/mL重組質(zhì)粒中擴增出特異性的目標片段，對健康蝦、WSSV陽性蝦、BP陽性蝦、IHHNV陽性蝦、HPV陽性蝦、YHV陽性蝦、IMNV陽性蝦和TSV陽性蝦的檢測均呈陰性，證明該 RT-PCR檢測方法對凡納濱對蝦野田村病毒有高度特異性和靈敏度。本研究建立的RT-PCR檢測方法，相對于其他檢測方法，有操作簡單、檢測時間短等優(yōu)越性，可在4 h內(nèi)完成大量樣品的檢測，適用于對大量臨床樣品的快速檢測。

對采集的386份臨床樣品檢測結(jié)果顯示，野田村病毒在福建地區(qū)的檢出率較高，可能與樣品的采集時間和野田村病毒的流行水溫有關(guān)，福建地區(qū)的樣品主要采集于3月份，池塘水溫24 ℃。進一步對陽性樣品測序比對，結(jié)果準確，表明該方法可應(yīng)用于臨床病料的檢測。本研究建立的RT-PCT檢測方法，可為凡納濱對蝦野田村病毒的流行情況和傳播途徑的調(diào)查提供可靠的技術(shù)手段，為臨床對該病的預(yù)防控制提供理論依據(jù)。