動物園初生珍禽禽流感、新城疫母源抗體檢測及免疫程序研究

李興玉 ，王 強 ，林 毅 ，鄧家波 ，廖黨金 *，牛李麗

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.成都市動物園＆成都野生動物研究所，四川 成都 610081）

禽流感病毒廣泛存在于世界范圍內(nèi)的家禽和鳥體內(nèi)，野生水禽被認為是禽流感病毒主要的自然儲存宿主。近十年來，已有研究報道高致病性禽流感可引起野生黑天鵝、斑頭雁、棕頭鷗發(fā)病死亡，并從野生鳥類中分離出高致病性H5N1病毒。新城疫病毒同樣在世界范圍內(nèi)的家禽和多種鳥類身上存在可造成家禽感染發(fā)病死亡，多種野鳥被認為是新城疫病毒的自然儲存庫。成都動物園目前有百鳥苑、鸚鵡館、水禽湖等，飼養(yǎng)著孔雀、黑天鵝等多種珍禽。動物園每年都有一定數(shù)量的初生珍禽孵出，因此做好雛禽禽流感、新城疫等重要疫病的免疫預(yù)防對于珍禽的繁育工作具有重要意義。但是，目前動物園尚未建立起一套針對初生珍禽的免疫程序，國內(nèi)外可以借鑒的此類研究非常有限，因此，本項目組采集了初生珍禽的血清用于測定母源抗體，并對所測數(shù)據(jù)進行分析，以建立一套適合初生珍禽的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 成都動物園圈養(yǎng)的孔雀、綠頭鴨等6種初生珍禽。

1.1.2 試驗疫苗 禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗：哈維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（LaSota株 +M41株）：齊魯動物保健有限公司生產(chǎn)；雞新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）：哈維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測試劑 H5亞型禽流感抗原、陽性血清和H9亞型禽流感抗原、陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；雞新城疫血凝抑制試驗抗原、陽性血清，購自青島易邦生物工程公司。

1.1.4 1%紅細胞懸液 采集3只無禽流感、新城疫抗體的青年健康公雞血液與等體積的阿氏液混合，用pH值為7.2的0.01mol/L PBS液離心洗滌3次，然后用該PBS液配成體積分數(shù)為1%的紅細胞懸液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 采用胸部肌肉或皮下注射的方法同時免疫禽流感（H5+H9）二價滅活疫苗、新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗，免疫劑量為0.3～0.5mL/羽；同時用2頭份/羽的免疫劑量滴鼻免疫雞新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）。

1.2.2 血清采集 15日齡以下的初生珍禽在心臟采血，其余珍禽在翅靜脈采血，待血清析出后，8 000 r/min離心4min，吸出血清并編號，－20℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 抗體檢測 參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003)和《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550-2008)標準，采用血凝抑制試驗方法檢測血清中的禽流感、新城疫抗體。

1.2.4 結(jié)果判定 以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價，只有陰性對照孔效價不大于2log2，陽性對照孔誤差不超過1個log2，試驗結(jié)果才有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 初生珍禽母源抗體的檢測結(jié)果 在2012年雛禽的出孵季節(jié)，采集了15日齡左右初生珍禽的9份血清進行母源抗體測定，檢測結(jié)果見表1。表1顯示6種初生珍禽的禽流感、新城疫母源抗體較好，其中白冠長尾雉、孔雀、白鷴、藍鷴的母源抗體基本在5log2以上，綠頭鴨的禽流感母源抗體較差，但也在4log2以上，未免疫成年大雁所產(chǎn)的雛雁也檢出了低效價的母源抗體。

表1 初生珍禽母源抗體測定結(jié)果log2

母源抗體雖然能使幼禽抵御感染獲得被動性免疫保護，但卻可能干擾疫苗（特別是弱毒苗）對雛禽的免疫效果，因此確定雛禽的首免日齡很關(guān)鍵。一般選擇雛禽的母源抗體達到免疫保護臨界值時對雛禽進行首免，這樣既可使雛禽獲得母源抗體的保護，又可減少母源抗體對免疫效果的干擾。分析近年來家禽及孔雀、鴕鳥等雛禽禽流感、新城疫母源抗體的消長規(guī)律，可知雛禽的免疫抗體在10日齡內(nèi)達高峰以后隨著日齡增加母源抗體逐漸消失。母源抗體的消失時間與母源抗體的基礎(chǔ)水平呈正相關(guān)，即母源抗體基礎(chǔ)水平越高，則消失時間越長。不同品種的雛禽，其母源抗體半衰期有差異，但一般為4d左右下降一個滴度。本次試驗參照家禽禽流感、新城疫免疫程序，初步建立了初生珍禽的免疫程序：15日齡首免，首免后1個月加強免疫1次。

2.2 初生珍禽免疫后對AI、ND抗體的測定 為了檢測上述免疫程序的免疫效果，在加強免疫后1個月采集了白冠長尾雉等5種初生珍禽的25份血清進行了免疫抗體檢測，結(jié)果見表2。

表2 初生珍禽免疫后的抗體檢測結(jié)果

上述初生珍禽的免疫抗體檢測結(jié)果顯示：初生珍禽產(chǎn)生了較好的免疫抗體，白冠長尾雉、孔雀等種珍禽群體在加免后1個月，禽流感H5、H9亞型的HI抗體幾何平均值分別為7.6log2、7.2log2，免疫合格率分別為100%、84%，白冠長尾雉、孔雀、白鷴3種幼禽的新城疫抗體幾何平均值為7.18log2，免疫合格率達94.12%。

3 結(jié)論及分析

由于珍禽價值昂貴，數(shù)量較少，采樣難度大，特別是初生珍禽的采樣難度更大，部分初生珍禽甚至在前期采血過程中即死亡，因此本試驗僅檢測了9日齡左右初生珍禽的母源抗體效價，未能測定初生珍禽母源抗體的消長規(guī)律，而主要參照了家禽及孔雀、鴕鳥等相關(guān)禽類母源抗體的消長規(guī)律，以此來建立初生珍禽的免疫程序。為了檢測該免疫程序的免疫效果，在雛禽加免后1個月筆者又進行了免疫抗體測定，其結(jié)果顯示：所免疫的5種珍禽的禽流感免疫抗體幾何平均值都超過了5log2；免疫的3種珍禽的新城疫免疫抗體幾何平均值超過了6log2，均超過了農(nóng)業(yè)部禽流感、新城疫免疫監(jiān)測方案中“禽流感免疫抗體效價應(yīng)≥4log2，新城疫免疫抗體效價應(yīng)≥5log2，免疫合格率≥70%”的標準。說明所建立的初生珍禽禽流感、新城疫的免疫程序比較合理，這對于國內(nèi)動物園建立初生珍禽免疫程序具有重要的借鑒意義。

參與文獻：

[1] 曾祥偉，華育平，李曉冰.三江自然保護區(qū)野生遷徙水禽攜帶禽流感病毒和新城疫病毒狀況的監(jiān)測[J].微生物報，2008，（10）：1403-1407.

[2] M.A.De Marcol，E.Foni，L.Campitelli，et al.Long term monitoring for avian influenza viruses in wild bir species in Italy[J].Veterinary Research Communications 2003，27（s）：107-114.

[3] Scott Krauss， David Walker， Paul Pryor， et al.In fluenza a viruses of migrating wild aquatic birds i north America[J].Vector Borne and Zoonotic Disease 2004，（3）：177-189.

[4] 鄭 潔，何玉邦.對青海湖區(qū)野生鳥類禽流感疫情防控幾點思考[J].野生動物雜志，2006，27（5）：19-21.

[5] M.A.Hoquea， G.W.Burgess， D.Karo-Karo， et a Monitoring of wild birds for newcastle disease virus i north queensland，Australia[J].Preventive Veterinar Medicine，2012，43：49-62.

[6] 姬學(xué)謙.雛七彩山雞新城疫的診斷與防制[J].中國獸醫(yī)技，2002，（11）：35.

[7] 張評滸，任濤，唐應(yīng)華，等.免疫程序與母源抗體對H5流感疫苗免疫鴨和鵝HI抗體水平的影響[J].中國獸醫(yī)技，2005，35（8）：638-642.

[8] 陳一兵，劉岳龍，解增俊，等.幾種家禽新城疫母源抗體化規(guī)律的研究[J].揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）2004，（4）：65-67.

[9]雞新城疫母源抗體消長規(guī)律和免疫保護抗體臨界值測定[J].當(dāng)代畜牧，2007，（3）：9-10.

[10]劉振湘，曾元根，唐曉玲，等.雛鴕鳥新城疫母源抗體水動態(tài)監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志，2002，38（9）：22-23.