泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的分離及初步鑒定

丁 瑋，呂成群，黃寶靈，李昆龍 ，陳振飛，任 涵，康 凱

（1.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西綠桐林業(yè)科技有限公司，廣西 南寧 530028）

【研究意義】泡桐（Paulownia）為玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬（Paulownia）落葉喬木，原產(chǎn)中國，在國內(nèi)25個(gè)省（市、區(qū)）有自然分布，是我國栽培歷史最悠久的樹種之一［1-3］。泡桐作為我國最重要的造林樹種之一，具有生長迅速、生長周期短等特點(diǎn)，其材質(zhì)輕而韌、不翹裂，具有防潮隔熱、耐酸耐腐等性能，是制造家具、膠合板及造紙等的良好材料［4-5］。生物固氮是指固氮微生物將大氣中游離態(tài)氮轉(zhuǎn)化為化合態(tài)氮的過程，即將不能被植物所利用的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為能夠被植物利用的氮的過程，是地球上氮循環(huán)的一個(gè)重要組成部分［6］。非豆科植物同與之共生的微生物組成的固氮系統(tǒng)，在自然界中占據(jù)了重要地位。因此，研究泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌與泡桐的固氮結(jié)瘤情況，對(duì)探索構(gòu)建非豆科樹木的固氮體系以及發(fā)現(xiàn)新的固氮菌和固氮結(jié)瘤樹種作為新的種質(zhì)資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】對(duì)根瘤內(nèi)生菌的研究，主要集中在大豆、胡盧巴、苜蓿等豆科植物［7-9］。對(duì)非豆科植物的研究中，黃寶靈等［10］發(fā)現(xiàn)羅漢松根際存在結(jié)瘤現(xiàn)象并分離出一株根瘤內(nèi)生細(xì)菌LHS9601；馮健玲等［11］從楊梅根瘤中分離獲得3個(gè)弗蘭克氏菌屬的內(nèi)生菌株MF3、MF6和MF9；周德明等［12］從四川榿木和臺(tái)灣榿木根瘤中分離出菌株AC0812S009和AC0812T017兩株根瘤內(nèi)生菌，并初步判定為弗蘭克氏菌；宋福強(qiáng)等［13］從沙棗根瘤內(nèi)成功分離和鑒定出27個(gè)純菌株，其中有4株放線菌、14株細(xì)菌、9株真菌；張愛梅等［14］通過高通量測(cè)序?qū)?個(gè)不同海拔西藏沙棘根瘤中的菌群組成和多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明除了能與沙棘共生固氮的弗蘭克氏菌外，還存在其他微生物群落。【本研究切入點(diǎn)】雖有研究報(bào)道非豆科植物具有結(jié)瘤固氮現(xiàn)象并對(duì)其根瘤內(nèi)生菌進(jìn)行了鑒定，但與豆科植物的共生固氮相比，對(duì)非豆科植物的固氮研究卻少得多。通過野外調(diào)查，發(fā)現(xiàn)泡桐根際存在結(jié)瘤現(xiàn)象，但對(duì)其與固氮微生物共生形成根瘤以及根瘤內(nèi)生菌的分離鑒定至今國內(nèi)外尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對(duì)從廣西欽州市采集的泡桐根瘤樣品進(jìn)行分離，通過傳統(tǒng)生理生化特性研究、16S rDNA全序列分析測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)分離純化的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，為深入研究泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)瘤固氮特性和對(duì)植株生長的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣西欽州市。欽州市屬亞熱帶季風(fēng)海洋氣候，年平均氣溫22℃，1月氣溫全年最低，平均氣溫在10℃以上。年均雨量為2 104.2 mm，夏、秋兩季濕熱多雨，降雨量占全年81.7%，年均蒸發(fā)量1 652.5 mm，空氣相對(duì)濕度81%，冬季為干冷少雨季節(jié)，雨量不大，降水量僅占全年雨量的5.9%，屬于丘陵地貌，采集樣地土壤為砂壤土。

1.2 根瘤的采集、分離和純化

于2017年9月30日從廣西欽州市泡桐林采集結(jié)瘤量多的新鮮細(xì)根，選取飽滿、個(gè)大的根瘤用自來水沖洗表面泥沙，在無菌操作條件下，分別用75%酒精和0.1%升汞進(jìn)行表面消毒，用無菌水沖洗干凈后，將根瘤置于滅過菌的研缽中研磨，加入少量無菌水，用接種針蘸取汁液在加入剛果紅的YMA［15］培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，28℃培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，挑取對(duì)剛果紅不吸色的單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化。

1.3 生理生化試驗(yàn)

3-酮基乳糖反應(yīng)、牛肉膏蛋白胨實(shí)驗(yàn)、利用碳源實(shí)驗(yàn)、利用氮源實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽生長等均按常規(guī)方法［16］進(jìn)行；B.T.B反應(yīng)參照黃維南等［17］的方法，在1 000 mL YMA培養(yǎng)液中加入0.5%溴麝香草酚藍(lán)溶液5 mL，接種1周后觀察結(jié)果，以不接種為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.4 16S rDNA全序列測(cè)定和分析

1.4.1 細(xì)菌DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增 將純化后的細(xì)菌菌株接種于YMB培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期，提取基因組DNA。分別以供試9株菌株的總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA特異引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò) 增 體 系：DNA模 板 1.0 μL；27F（10μmol/L）0.8 μL；1492R（10 μmol/L）0.8 μL；2×PCR Mix 10 μL；雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增到長約1.5 kb的PCR反應(yīng)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技公司測(cè)序。

1.4.2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將雙向測(cè)序獲得的16S rDNA全序列在生物技術(shù)信息網(wǎng)頁http://www.ncbi.nlm.nib.gov/進(jìn)行BLAST序列分析及同源性比較，找到與GenBank中同源性高的相關(guān)序列作為參照菌株。用MEGA 5.0中的鄰接法（neighbor-joining method）自舉值（Boot-strap）1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

經(jīng)過分離純化獲得9株泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌，所有菌株在YMA培養(yǎng)基上第1天內(nèi)生長少；第2天開始大量生長，由表1可知，形成明顯菌落，大部分菌落表面濕潤、有光澤。除菌株P(guān)G-7外，其余菌株形態(tài)都為桿狀，革蘭氏染色均為陰性，有鞭毛，無芽孢，只有33%的菌株有莢膜。從總體形態(tài)特征觀察結(jié)果來看，從泡桐根瘤分離的菌株菌落特征與根瘤菌的菌落具有更多相似性。

表1 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Results of morphological character tests of endophytic bacteria of Paulownia root nodules

2.2 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特性

2.2.1 碳源利用 由表2可知，不同菌株對(duì)不同碳源利用效果不同，能不同程度地利用單糖和雙糖。9株供試菌株在無糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長一般，PG-3不能在添加有麥芽糖的培養(yǎng)基上生長，PG-5對(duì)碳源要求最高、不能利用蔗糖，且在含其余7種碳源培養(yǎng)基上均生長較差。除PG-5和PG-3外，其余菌株均能利用供試的5種單糖和3種雙糖，絕大部分菌株生長良好。

表2 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌碳源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the carbon sources utilization test of endophytic bacteria of Paulownia root nodules

2.2.2 無機(jī)氮源利用 從表3可以看出，不同菌株對(duì)無機(jī)氮源的利用情況不同。第7天時(shí)，除PG-6、PG-8菌株外，其他菌株均能利用銨態(tài)氮為氮源，占全部菌株的78%；除PG-5菌株外，其余菌株均能利用硝態(tài)氮為氮源，占全部菌株的89%，表明絕大多數(shù)菌株能較好地將無機(jī)氮源轉(zhuǎn)化為可利用氮源。PG-3和PG-5在第3天時(shí)，分別不能利用硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，而在第7天時(shí)均能利用這兩種氮源，說明菌株在不同生長時(shí)期對(duì)于氮源的利用有差異。

2.2.3 部分生理生化反應(yīng) 表4顯示，所有供試菌株的淀粉水解和3-酮基乳糖反應(yīng)均呈陰性，除PG-8菌株外都能利用檸檬酸鹽；在B.T.B反應(yīng)試驗(yàn)中，除PG-7菌株產(chǎn)堿外，其余菌株均產(chǎn)酸。供試菌株中有3株能還原硝酸鹽，占全部菌株的33%。有56%的菌株能在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好。

表3 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌無機(jī)氮源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the inorganic nitrogen sources utilization test of endophytic bacteria of Paulownia root nodules

表4 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌部分生理生化特性Table 4 Parts of the physiological and biochemical characteristics of endophytic bacteria of Paulownia root nodules

2.3 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果

2.3.1 16S rDNA序列分析 將所測(cè)得的16S rDNA全序列輸入生物技術(shù)信息網(wǎng)頁http://www.ncbi.nib.gov/，用BLAST程序與GenBank上的參比菌進(jìn)行序列分析及同源性比較，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)G-3、PG-5、PG-6、PG-8、PG-9與數(shù)據(jù)庫中根瘤菌屬的同源性達(dá)到100%。因此，可將分離出的泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌分為根瘤菌屬、土壤桿菌屬、草螺菌屬、伯克氏菌屬4類，表明泡桐瘤內(nèi)生細(xì)菌具有遺傳多樣性。

表5 泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果分類Table 5 The classification according to the results of 16S rDNA sequence blast of endophytic bacteria of Paulownia root nodules

2.3.2 16S rDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將9株泡桐根瘤內(nèi)生菌株的16S rDNA全序列通過系統(tǒng)發(fā)育分析得出各菌株間相似性及系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（圖1），圖1顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，26個(gè)菌株分別聚類于不同分支，供試的PG-1和PG-2菌株處于土壤桿菌屬（Agrobacterium）和根瘤菌屬（Rhizobium）的交叉分支中，并與土壤桿菌屬的遺傳距離最近，同源性達(dá)到100%，因此可以確定菌株P(guān)G-1和PG-2是隸屬于Agrobacterium屬的種。PG-3、PG5、PG-6、PG-7和PG-8與根瘤菌屬不同的種構(gòu)成分支，PG-6、PG-8和PG-9處于同一分支中，且PG-8和PG-9具有98%的相似水平，可能為同一個(gè)種，與Rhizobium multihospitiumstrain XM06（MK249668.1）菌株的遺傳距離最近、同源性為96%。PG-4與Herbaspirillumsp. RFNB25（FJ266335.1）的遺傳距離最近、同源性為100%，PG-7與Burkholderiasp. G103（KJ948371.1）的同源性為100%。根據(jù)16S rDNA全序列和16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，確定PG-3、PG-5、PG-6、PG-8和PG-9菌株均屬于根瘤菌屬，PG-4屬于草螺菌屬（Herbaspirillum），PG-7屬于伯克氏菌屬（Burkholderia）。

圖1 基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic dendrogram of 26 strains based on 16S rDNA gene sequences

3 討論

從泡桐樹根瘤上經(jīng)分離、純化獲得9個(gè)根瘤內(nèi)生菌株，在生理生化方面具有明顯差異性，表現(xiàn)出菌株的復(fù)雜性和多樣性。根瘤菌是一類革蘭氏染色為陰性的桿狀細(xì)菌，一般不具有芽孢。本試驗(yàn)分離的9株泡桐根瘤內(nèi)生細(xì)菌菌株中，所有菌株革蘭氏染色均為陰性，且均不具有芽孢，除菌株P(guān)G-7外，其余菌株形態(tài)均為桿狀。

根據(jù)1984年Jordan等報(bào)道，根瘤菌區(qū)別于其他土壤桿菌的反應(yīng)特征是不能利用3-酮基乳糖、檸檬酸鹽和淀粉、不液化明膠。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看，并不能完全根據(jù)上述反應(yīng)特征進(jìn)行區(qū)別。根據(jù)資料報(bào)道，采集自不同區(qū)域、不同宿主植物的根瘤菌在生理生化特性方面都有不同性質(zhì)。供試菌株中只有一株菌株不能利用檸檬酸鹽，有相關(guān)研究表明根瘤菌也能利用檸檬酸鹽［18-19］。供試菌株大部分能在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好，劉靈芝等［20］對(duì)北方地區(qū)大豆根瘤菌研究發(fā)現(xiàn)，部分菌株表現(xiàn)牛肉膏蛋白胨陽性反應(yīng)，但韋原蓮等［21］、呂成群等［22］研究表明所有根瘤菌均不能利用牛肉膏蛋白胨。在B.T.B試驗(yàn)中，只有一株菌株產(chǎn)堿，其余都產(chǎn)酸。多數(shù)供試菌株能不同程度地利用KNO3和（NH4）2HPO4兩種氮源。一般情況下，根瘤菌能利用各種糖，特別是快生根瘤菌對(duì)糖的種類選擇性不強(qiáng)［23］。在本試驗(yàn)中，絕大部分菌株都能在含有碳源的培養(yǎng)基上生長良好。經(jīng)初步鑒定，所有菌株在生理生化特性中表現(xiàn)出一些根瘤菌的特性，但也表現(xiàn)出一些與根瘤菌不相符的特性，因此，對(duì)于這些菌株的分類地位還無法確定，需要進(jìn)一步研究。

通過對(duì)9株供試菌株進(jìn)行16S rDNA全序列比對(duì)結(jié)果，確定9株供試菌株可分為4個(gè)細(xì)菌屬。PG-3、PG-5、PG-6、PG-8和 PG-9等 5個(gè) 菌株屬于根瘤菌屬，占所有菌株的56%；PG-1和PG-2為土壤桿菌屬，占供試菌株的22%；PG-4屬為草螺菌屬；PG-7為伯克氏菌屬。伯克氏菌（Burkholderia）在農(nóng)業(yè)上可作為生物降解、生物控制及促進(jìn)植物生長的根圈微生物，楊群［24］對(duì)厚莢相思樹種根瘤菌的多樣性研究中，也分離出一株隸屬于伯克氏菌屬的菌株QX6-8，回接時(shí)單株結(jié)瘤數(shù)最高，結(jié)瘤率也達(dá)到了100%。草螺菌（Herbaspirillum）是一類可在高糖培養(yǎng)基上生長但不利用蔗糖的新細(xì)菌類群，但在本試驗(yàn)中，菌株P(guān)G-4卻能利用蔗糖。王婷等［25］研究發(fā)現(xiàn)，兩株茶樹內(nèi)生草螺菌均不具備固氮酶活性，而王秀呈等［26］從水稻根部分離出一株具有高效固氮酶活的草螺菌屬菌株DX35，說明同屬內(nèi)生細(xì)菌不同種類生理功能呈現(xiàn)明顯的多樣性。本試驗(yàn)中PG-4是否具有固氮酶活性，還需進(jìn)一步研究。土壤桿菌（Agrobacterium）是屬于根瘤菌科的革蘭氏陰性細(xì)菌，但不固氮，絕大多數(shù)能使植物致癌，本試驗(yàn)在泡桐根瘤內(nèi)分離出了土壤桿菌，說明存在癌變的潛在可能，需要及時(shí)防治。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，分離自同一寄主的根瘤內(nèi)生細(xì)菌其生理生化特性方面存在較大的差異性，因此認(rèn)為細(xì)菌在進(jìn)化過程中，受到生態(tài)環(huán)境的影響，使其生理生化性質(zhì)也受到了改變，表現(xiàn)出了豐富的多樣性。從泡桐根瘤內(nèi)分離純化到的9株菌株，經(jīng)鑒定分為4個(gè)屬，其中根瘤菌處于優(yōu)勢(shì)地位，其次還有土壤桿菌屬、草螺菌屬和伯克氏菌屬，這表明泡桐瘤內(nèi)生細(xì)菌具有遺傳多樣性，這些差異也為泡桐在林業(yè)上的生產(chǎn)應(yīng)用提供了多樣的、可供選擇的資源。泡桐作為我國重要的速生造林樹種之一，想要提高林木生產(chǎn)量、降低營林成本，對(duì)其接種與之相適應(yīng)的、共生固氮性能良好的根瘤內(nèi)生菌非常重要。需進(jìn)一步探討泡桐樹種根瘤內(nèi)生菌的侵染結(jié)瘤特性，并為篩選優(yōu)良泡桐樹種根瘤內(nèi)生菌提供依據(jù)。