海水脅迫對冰菜細胞損傷和有機小分子滲透調節物質積累影響

段瑞軍，吳朝波 ，王 軍，黃圣卓，梅文莉，戴好富

（1.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101；2.海南好授粉農業科技服務有限公司，海南 樂東 570228；3.海南正和職業培訓學校，海南 ?？?571101）

【研究意義】植物對鹽漬化生境的適應實現方式主要通過滲透調節、肉質化、離子區域化、鹽離子選擇性吸收及氣孔泌鹽等作用，其中滲透調節為主要方式，植物細胞中合成有機小分子溶質為滲透調節的方式之一。研究發現，鹽脅迫下，植物積累脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖和多胺等有機小分子滲透調節物質，行使其調節、保護、清除活性氧、促進生長等功能，在植物耐鹽性上具有重要作用［1］?！厩叭搜芯窟M展】冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.）葉片肉質化、嬌嫩、較脆，富含葉酸、β-胡羅素、蛋白質和多種微量元素，營養豐富［2］，可在含鹽度與海水等同（含鹽度3.5%）的條件下正常生長，是理想的鹽堿地推廣蔬菜，為理想的島礁蔬菜種植候選品種。目前關于冰菜的研究主要集中在栽培種植方面［3-4］，其生理生化方面僅有一些零星報道［5-6］。【本研究切入點】筆者所在課題組自引種冰菜在海南文昌鹽堿地試種以來，通過不同濃度海水處理所在課題表明，冰菜在0～100%濃度下均能完成生活史，但海水濃度高于60%冰菜生長受到抑制，并對其抗氧化酶系統進行了研究［7］。【擬解決的關鍵問題】為進一步摸清冰菜耐鹽生理機理，優化了試驗處理，測定不同濃度海水下膜質過氧化產物（MDA）和細胞膜透性，獲取不同濃度海水下細胞膜的損傷情況，同時測定脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等有機小分子滲透調節物質的含量變化，以期揭示冰菜有機小分子滲透調節物質與海水脅迫的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冰菜種子收集于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所文昌試驗基地，海水取自?？谑邪咨抽T。

1.2 試驗方法

試驗在中國熱帶農業科學院生物技術研究所進行，2018年3月播種育苗，冰菜苗長出4片真葉時進行移栽，在前期研究基礎上設置5個濃度（20%、30%、40%、50%、60%）海水。移栽后一周進行海水處理，每周澆2次。分3個時期（即出現一級分枝、二級分枝、三級分枝）采集相同部位葉片進行MDA、細胞膜透性指標和脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等有機小分子滲透調節物質含量測定。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法［8］，細胞膜透性測定采用電導率法［9］，脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色比色法［10］；甜菜堿含量測定采用雷氏鹽沉淀法［11］，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法稍作改進［12］。

數據用Excel 2003整理，并繪制圖表；用SPSS13.0進行方差分析和多重比較，進行統計顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度海水對冰菜MDA含量和細胞膜透性的影響

逆脅迫下質膜是首先受到攻擊的目標之一，膜質受到損傷，膜脂過氧化產物MDA含量增加、膜透性增強。根據不同濃度海水下、不同生長時期的冰菜MDA含量（圖1）可知，冰菜在20%濃度海水處理下，MDA含量最低。一級分枝和二級分枝MDA含量增長規律一致，在20%～40%濃度海水處理下細胞中MDA含量積累無顯著增加，當海水濃度≥40%時，細胞中MDA積累量顯著增加。濃度海水達到60%時，一級分枝、二級分枝中MDA含量分別是20%濃度的1.56、1.70倍。三級分枝中MDA含量在海水濃度為50%時達到最大，是20%濃度的2.56倍，之后呈下降趨勢。在相同海水濃度下，隨著冰菜生長，MDA積累量不斷增加，且濃度越高，積累量越多，20%、30%、40%、50%濃度海水脅迫下，三級分枝MDA含量分別比一級分枝增加0.57、0.79、0.88、0.91倍。

圖1 海水脅迫對冰菜MDA含量的影響Fig. 1 Effects of seawater stress on MDA content of M. crystallinum L.

冰菜細胞膜透性結果（圖2）表明，相同海水濃度下，冰菜細胞膜受損傷程度為三級分枝＞二級分枝＞一級分枝，在20%、30%、40%、50%、60%濃度海水脅迫下細胞膜透性三級分枝分別是一級分枝的2.09、1.72、1.33、1.65、1.42倍；同一分枝在不同海水濃度脅迫下，細胞膜透性隨海水濃度增加而增強，冰菜細胞一級分枝、二級分枝、三級分枝膜透性在60%濃度海水脅迫下分別是20%濃度海水下的4.38、3.01、2.98倍。

圖2 海水脅迫對冰菜細胞膜透性的影響Fig. 2 Effects of seawater stress on cell membrane permeability of M.crystallinum L.

2.2 不同濃度海水對冰菜脯氨酸積累量的影響

脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，本試驗將脯氨酸含量作為抗逆育種的重要生理指標。另外，由于脯氨酸親水性極強，能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程，能降低凝固點,可防止細胞脫水。由圖3可知，不同濃度海水處理對各級分枝的影響總體趨勢相似，脯氨酸含量在三級分枝中最高，其次為二級分枝，一級分枝中最少。當海水濃度≤30%時，隨著海水濃度升高，脯氨酸含量增加，二級分枝較顯著。當海水濃度≥30%時，隨著濃度海水增加，脯氨酸含量呈現降低趨勢，二級分枝和三級分枝下降顯著。不同分枝中，30%濃度海水處理下脯氨酸含量升高顯著，其中二級分枝和三級分枝脯氨酸含量已超過25 μg/g。一級分枝脯氨酸含量在各濃度海水處理下變化沒有二級分枝和三級分枝明顯。

圖3 海水脅迫對冰菜脯氨酸含量的影響Fig. 3 Effects of seawater stress on proline content of M. crystallinum L.

2.3 不同濃度海水對冰菜可溶性糖積累量的影響

可溶性糖在冰菜生長發育中具有重要作用，不僅為各時期提供能量和代謝中間產物，且具有信號功能，也是植物生長發育和基因表達的重要調節因子。圖4所示，不同濃度海水處理在各級分枝呈現相同的影響趨勢，均隨著濃度海水升高，可溶性糖含量增加，且含量呈現三級階梯式顯著升高；各級分枝高濃度海水脅迫下，可溶性糖含量顯著高于低濃度處理，其中60%濃度海水處理下可溶性糖含量為20%處理的近2倍。不同濃度海水對一級分枝影響不如二級分支和三級分枝明顯，因為一級分枝可溶性糖含量普遍較低，約為其他分枝的50%。

圖4 海水脅迫對冰菜可溶性糖含量的影響Fig. 4 Effects of seawater stress on content of soluble sugar of M. crystallinum L.

2.4 不同濃度海水對冰菜甜菜堿積累量的影響

圖5 海水脅迫對冰菜甜菜堿含量的影響Fig. 5 Effects of seawater stress on content of betaine of M. crystallinum L.

甜菜堿的積累對維持細胞內外的滲透平衡與細胞的正常生理活動有重要意義。本試驗結果表明：不同海水濃度下，當海水濃度為20%～60%時，冰菜一級、二級分枝甜菜堿含量隨海水濃度的增加而增加，當海水濃度為20%時，一級、二級分枝中甜菜堿含量分別為1 800、2 324 μg/g，當海水濃度達60%，甜菜堿含量明顯增加，分別是20%海南濃度下的2.43、3.02倍。三級分枝中甜菜堿呈先增大后減小的趨勢，在40%海水濃度下達到最大值（7 455 μg/g），為20%、60%下的1.82、2.32倍。相同海水濃度下，在20%～60%濃度海水脅迫下，一級、二級分枝在相同濃度下甜菜堿含量均呈增加趨勢，60%濃度海水脅迫下冰菜一級、二級分枝甜菜堿積累量分別是20%濃度處理的2.27、2.29、2.05、1.53倍。60%濃度海水脅迫下，甜菜堿積累量二級分枝＞一級分枝＞三級分枝。

2.5 膜損傷指標、有機小分子、海水間的相關性分析

分析不同海水濃度下各指標相關性（表1）可知，海水濃度與膜損傷指標細胞膜透性極顯著正相關，相關系數為0.972，與膜質過氧化產物MDA呈顯著正相關，相關系數為0.957；海水濃度與甜菜堿含量呈正相關，其中與可溶性糖含量呈極顯著正相關，與脯氨酸積累量呈負相關。電導率、MDA與可溶性糖含量呈極顯著正相關，相關系數分別為0.966、0.963?？扇苄蕴欠e累與脯氨酸積累呈顯著負相關，相關系數為0.907。綜合分析可知，有機小分子滲透調節物質可溶性糖的積累能對膜損傷做出最快速的反應。

表1 冰菜在海水脅迫下各試驗指標之間的相關性分析Table1 Correlation analysis of various test indexes of M. crystallinum L. under seawater stress

2.6 海水脅迫與各有機小分子滲透調節物質間在各生長時期的相關性分析

由圖6A可知，冰菜一級分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈低度負相關，相關系數為0.073；冰菜二級分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈中度負相關，相關系數為0.651；冰菜三級分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈高度負相關，相關系數為0.894。即冰菜生長期越長，脯氨酸與海水脅迫的相關性越高。由圖6B可知，冰菜一級分枝可溶性糖積累量與海水濃度呈顯著正相關，相關系數為0.850；冰菜二級、三級分枝可溶性糖積累量與海水濃度呈極顯著正相關，相關系數分別為0.966、0.955。即冰菜各生長期時期、各海水濃度下，可溶性糖均能對海水脅迫做出響應。由圖6C可知，冰菜一級分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈極顯著正相關，相關系數為0.950；二級分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈顯著正相關，相關系數分別為0.906；三級分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈低度負相關，相關系數分別為0.015。即冰菜生長前期，甜菜堿能及時為對海水脅迫做出響應，隨著冰菜生長，甜菜堿對海水脅迫響應逐漸減弱。

圖6 海水濃度與脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的相關性分析Fig. 6 Correlation analysis of seawater concentration with proline, soluble sugar and betaine

3 討論

3.1 海水脅迫對冰菜細胞膜的損傷

逆境脅迫下植物細胞內自由基代謝平衡遭到破壞，導致膜脂透性增大、膜脂過氧化物積累，使細胞膜系統嚴重受損。研究發現，鹽濃度與細胞膜透性呈正比［13］。電解質外滲率即電導率可以反映細胞膜透性，代表細胞膜系統的完整性，細胞膜透性越大表明膜系統受損程度越大。對白刺的耐鹽性研究發現，3種白刺的電導率值均隨鹽脅迫增加而增大［14］；丙二醛是膜脂過氧化產物，能與細胞內各種成分發生反應，進而引起膜損傷［15］，其含量高低可間接表現植物受逆境脅迫的強弱。孫海菁等［16］研究發現，在中低鹽度脅迫下細胞膜透性增加不明顯，而在高鹽度脅迫下迅速增加，與本研究結果一致。本研究表明，細胞膜透性、MDA均隨海水濃度增加而增加，在海水濃度為20%～60%范圍內，一級、二級分枝均無明顯增加，海水濃度為50%時，各級分枝MDA含量、細胞膜透性均較20%下顯著增加。同一海水濃度下，生長期越長，細胞膜透性越大，膜質過氧化產物MDA積累量越多，均呈現三級分枝＞二級分枝＞一級分枝的基本變化規律，表明，冰菜在20%～60%海水濃度范圍內，具有極強的抗鹽性。

3.2 海水脅迫有機小分子滲透調節物質的響應

鹽脅迫下植物細胞內大量失水，導致滲透脅迫，為維持植物正常的生理代謝，通過滲透調節降低細胞水勢來吸收水分。脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等有機小分子滲透調節物質，有助于植物調節細胞滲透壓，消除或減輕鹽脅迫損傷，維持植物生長。銀杏幼樹在鹽脅迫下，可溶性糖含量隨鹽濃度的升高和鹽脅迫時間延長呈先升后降趨勢，脯氨酸含量在鹽脅迫后期顯著增加［17］，枸杞幼苗在鹽脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量在不同處理時期均呈現上升趨勢［18］，花椰菜苗期鹽脅迫下脯氨酸含量與鹽濃度極顯著正相關［19］，對薊幼苗NaCl脅迫下游離脯氨酸含量先增后減?。?0］；不同牧草中可溶性糖含量變化不同，披堿草、草地早熟禾和星星草隨著鹽濃度的提高，可溶性糖含量呈現增高的趨勢，而老芒麥呈現先升后降的趨勢［21］。鹽脅迫后胡楊根葉中甜菜堿濃度顯著提高，在處理后15 d達到最高值，特別是葉片中甜菜堿的濃度提高243倍，達到1 899.8μmol/L，根中甜菜堿含量也增加了9倍［22］?？梢?，脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖在鹽脅迫下對植物抗鹽性具有重要作用，且各種植物中變化不一，但總的說來，鹽脅迫下，上述滲透調節物質均會不斷積累。本研究中，冰菜可溶性糖含量隨著海水濃度增加，積累量不斷增加，相同生長階段，不同分枝中在60%濃度海水處理下可溶性糖含量為20%處理下的近2倍，同一海水濃度處理，可溶性糖含量三級分枝＞二級分枝＞一級分枝。說明鹽脅迫時間越長、脅迫濃度越大，可溶性糖含量越高。脯氨酸含量在各級分枝中均表現出先增大后減小的趨勢，表明脯氨酸能對低濃度海水脅迫做出響應，隨著海水濃度增加，響應程度降低。甜菜堿在冰菜生長前期，即一級分枝、二級分枝表現為隨海水濃度增加，積累量增多，冰菜生長至三級分枝時，甜菜堿積累量呈現先增加后減小的趨勢；在20%～50%濃度海水下，同一濃度海水處理冰菜隨著生長期增長，其體內甜菜含量增加，表明甜菜堿在20%～50%海水處理下，能及時對鹽脅迫做出響應。

3.3 海水脅迫與膜損傷指標和有機小分子滲透調節物質的相關性

通過對MDA積累量、細胞膜透性、脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖與海水相關分析表明，膜損傷指標MDA含量、膜透性與海水脅迫具有較高的正相關性，表明海水濃度增加對冰菜損傷作用增強。海水濃度與甜菜堿含量呈正相關，其中與可溶性糖含量呈極顯著正相關，與脯氨酸積累量呈負相關；可溶性糖含量與細胞膜透性、MDA呈極顯著正相關。冰菜3個生長期（一級、二級、三級分枝）有機小分子滲透調節物質與海水脅迫的線性回歸分析結果表明，海水脅迫與冰菜生長一級分枝呈顯著正相關，與二級、三級分枝呈極顯著正相關。海水脅迫與甜菜堿的積累量相關性在一級分枝為極顯著正相關，二級分枝為顯著正相關，三級分枝為低度負相關，表明隨著冰菜的生長相關性逐漸降低，即冰菜生長前期，甜菜堿在滲透調劑中起著重要作用。海水脅迫與脯氨酸含量呈負相關，且處理時間越長負相關度越高，在三級分枝時呈現極顯著負相關，表明脯氨酸在鹽脅迫下隨著冰菜生長其調節作用在減弱。

4 結論

隨著海水濃度增強，處理時間延長，冰菜細胞膜內膜質過氧化產物MDA迅速積累，細胞膜透性增強，而冰菜在20%～60%海水處理下依然能正常生長，維持生物量，可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿均能做出不同程度的響應，調節冰菜細胞滲透壓，維持冰菜正常生理活動，促進冰菜生長。在參與滲透調節的有機小分子物質中，與海水脅迫的相關性表現為可溶性糖＞甜菜堿＞脯氨酸。