扁平苔癬HIF-1α、GLUT-1及MMP-2表達及意義

[摘要]目的探討扁平苔癬低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、葡萄糖轉運因子-1（GLUT-1）及基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達，并分析三者在扁平苔癬發病中的作用。方法應用免疫組織化學方法，檢測45例扁平苔癬病人皮損組織HIF-1α、GLUT-1及MMP-2蛋白表達和分布情況，以35例正常人皮膚組織作為對照。結果扁平苔癬皮損組織中HIF-1α、GLUT-1及MMP-2的表達陽性率分別為86.6%、88.9%和85.7%，均高于對照組（χ2=23.74～40.00，P<0.01）。扁平苔癬皮損組織中HIF-1α、MMP-2和GLUT-1表達均呈正相關（r=0.98～0.99，P<0.05）。結論扁平苔癬皮損組織中HIF-1α、GLUT-1及MMP-2均過表達，三者與扁平苔癬的發生與發展有關。

[關鍵詞]扁平苔癬;缺氧誘導因子1，α亞基;葡萄糖轉運體1型;基質金屬蛋白酶2;免疫組織化學

[中圖分類號]R758.65[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0350-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， glucose transporter 1 （GLUT-1）， and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in lichen planus and their role in the pathogenesis of lichen planus. Me-thodsImmunohistochemistry was used to measure the expression and distribution of HIF-1α， GLUT-1， and MMP-2 proteins in the skin lesions of 45 patients with lichen planus， and the skin tissue samples from 35 healthy individuals were collected as control group. ResultsIn the skin lesions of lichen planus， the positive rates of HIF-1α， GLUT-1， and MMP-2 were 86.6%，88.9%， and 85.7%， respectively， which were higher than the positive rates in the control group （χ2=23.74-40.00，Plt;0.01）. There was a positive correlation between HIF-1α， GLUT-1， and MMP-2 in the skin lesions of lichen planus （r=0.98-0.99，Plt;0.05）. ConclusionOverexpression of HIF-1α， GLUT-1， and MMP-2 is observed in the skin lesions of lichen planus， and HIF-1α， GLUT-1， and MMP-2 are associated with the development and progression of lichen planus.

[KEY WORDS]lichen planus; hypoxia-inducible factor 1， alpha subunit; glucose transporter type 1; "matrix metallopro-teinase 2; "immunohistochemistry

扁平苔癬（LP）原發損害為多角形扁平丘疹，好發于四肢伸側、軀干以及頸背部，往往伴有瘙癢，給病人帶來很大的苦惱[1]。研究顯示，LP是多種機制共同作用導致的免疫炎性疾病。近年來越來越多的研究表明，低氧環境下誘導的低氧誘導因子（HIF）在免疫炎癥反應中發揮著重要作用[2]。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）是以鋅離子為錨定結構的內肽酶家族，參與幾乎所有細胞的生化反應，其中的基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）可特異性水解Ⅳ型膠原。皮膚表皮基底層主要成分為Ⅳ型膠原，MMP-2平衡失代償會導致基底層液化變性[3]。既往多項研究顯示，葡萄糖轉運因子-1（GLUT-1）是受HIF-1調控的靶基因之一，低氧環境下HIF-1蛋白表達增高，并誘導下游因子GLUT-1蛋白表達，二者均參與細胞低氧調控的生化反應以適應低氧環境[4-5]。本文研究應用免疫組織化學方法，檢測HIF-1α、GLUT-1、MMP-2在正常皮膚組織、LP皮損組織中的表達情況，探討三者在LP中的表達及其之間是否存在相關性。現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1標本及其來源

2015年7月—2017年7月，收集我院黃島院區皮膚科診治的LP病人皮損組織45例，均經病理檢查確診。其中男24例，女21例;年齡20～60歲，平均（37.2±10.0）歲;病程3月～15年，平均10.33月。另取本院同期外科手術后病人的正常皮膚組織35例，其中男17例，女18例;年齡22～60歲，平均（38.5±10.0）歲。兩組年齡、性別差異無顯著性。所取標本均用40 g/L甲醛固定不超過24 h，石蠟包埋，切片。

1.2主要試劑

兔抗人HIF-1α多克隆抗體、兔抗人MMP-2多克隆抗體、兔抗人GLUT-1均購自青島云山公司;SP試劑盒購自福建邁新生物技術公司;通用型二抗（PV-6001）、 二氨基聯苯胺試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3檢測指標及方法

將組織切片置于烘片機中烘烤1 h，緩沖液沖洗3次，微波抗原修復20 min，加入30 g/L過氧化物酶1孵育10 min，微波加熱修復2 min，分別滴加一抗HIF-1α、MMP-2及GLUT-1（滴度分別為1∶200，1∶75和1∶150），37 ℃水浴1 h，加入通用型二抗PV-6001，置37 ℃恒溫箱45 min。 陽性對照采用自身對照，陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗。光鏡下觀察染色情況。

1.4結果判斷

HIF-1α和GLUT-1染色結果判定：隨機取切片四角及中央10個高倍視野進行觀察。細胞染色強度評分：3分，棕褐色染色;2分，棕黃色染色;1分，淺黃色染色;0分，細胞無顯色。再對陽性細胞百分比評分：lt;30%為1分;30%～70%為2分，gt;70為3分。根據染色強度和陽性細胞百分比評分相乘得分評定結果，lt;1分為陰性表達（-），≥1分為陽性表達（+）。MMP-2染色結果評定：陽性細胞百分數lt;10%為陰性（-），≥10%為陽性（+）。

1.5統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件進行統計學處理，計數資料比較采用χ2檢驗;相關性分析采用Spearman法。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組MMP-2表達比較

LP皮損組織中MMP-2陽性染色主要表現為表皮基底層細胞漿中出現棕黃色顆粒沉淀，對照組表皮無明顯染色或者可見淡黃色沉淀（圖1）。LP皮損組織中39例MMP-2陽性表達，表達陽性率為86.6%，高于正常皮膚組織（31.5%），差異有統計學意義（χ2=26.58，P<0.05）。

2.2兩組GLUT-1表達比較

LP皮損組織中GLUT-1陽性染色主要表現為基底層棕黃色顆粒沉淀，棘層及真皮淺層淋巴細胞亦出現陽性染色，棕黃色染色主要定位于細胞膜和極少量細胞漿;對照組無明顯著色（圖2）。LP皮損組織中有40例GLUT-1陽性表達，表達陽性率為88.9%，高于正常皮膚組織（20.0%），兩組比較差異有統計學意義（χ2=40.00，P<0.05）。

2.3兩組HIF-1α表達比較

HIF-1α陽性染色為基底層細胞及真皮淺層淋巴細胞胞核出現棕黃色顆粒，主要定位于核膜（圖3）。正常皮膚組織中HIF-1α不表達或少量表達;LP皮損組織中39例HIF-1α陽性表達，表達陽性率為86.7%，兩組比較差異有顯著意義（χ2=23.74，P<0.05）。

2.4LP皮損組織HIF-1α、MMP-2和GLUT-1表達的相關性

LP 皮損組織中HIF-1α與GLUT-1表達呈正相關（r=0.98，P<0.05），GLUT-1與MMP-2表達呈正相關（r=0.99，P<0.05），HIF-1α與MMP-2表達呈正相關（r=0.99，P<0.05）。

3討論

近年來研究表明，低氧微環境在免疫炎性疾病發生、發展中起重要作用[6]。有研究顯示，因炎癥因子刺激，皮膚免疫性疾病微環境常處于低氧狀態，微環境低氧會使機體產生保護性生理生化反應以維持血氧穩定。

HIF-1α作為低氧刺激下的主要的誘導反應蛋白，幾乎可產生于任何細胞，其主要作用包括提高代謝水平、維持血氧穩定以及促進生理生化反應增加氧含量[7]。同時，免疫炎性反應因子可通過MAPK等信號通路，間接地誘導HIF-1α高表達[8]。推測HIF-1α和其誘導的下游因子的協同作用可導致上皮細胞增殖和凋亡的失衡，但機制還有待進一步研究[9-10]。本文研究結果顯示，LP組HIF-1α表達陽性率及染色程度較正常對照組顯著增高，推測HIF-1α在LP的發生、發展中可能發揮重要作用。

GLUT-1是葡萄糖轉運蛋白主要反應元件，存在于各類細胞中，低氧、應激反應等可誘導GLUT-1蛋白表達，在低氧狀態下可被HIF-1α轉錄激活，調節下游因子，進而調控低氧狀態下細胞生理生化反應，促進細胞糖代謝和糖酵解，使細胞獲得更多能量來適應低氧的不利環境[11-12]。有研究顯示，GLUT-1蛋白在正常及良性上皮腫瘤中未見表達，而在肺癌、乳癌等惡性腫瘤中高表達[13]。另有研究顯示，體外低氧刺激細胞或者腫瘤細胞可激發與糖酵解相關酶和蛋白質明顯升高，其中GLUT-1可見顯著升高[14]。另有作者對卵巢癌組織研究發現，GLUT-1過表達在一定程度受HIF-1α調控，并且低氧環境可直接誘發GLUT-1的表達[15-16]。本文研究結果顯示，LP皮損組織中GLUT-1表達陽性率高于正常皮膚組織，差異有顯著性，推測GLUT-1在LP的發生、發展中可能有著重要的作用。

LP皮損組織上皮基膜和基底層角質形成細胞的錨定成分被破壞，從而導致上皮組織和其他連接的組織之間出現裂隙，這層連接組織主要成分為Ⅳ型膠原[17-18]。近年來研究顯示，MMP-2在LP及銀屑病等增殖性疾病中表達增高[19-20]。MMP-2及其調控因子的平衡失調，導致MMP-2降解減弱，增多的MMP-2過度破壞上皮的連接組織，從而誘發基底膜損傷，導致LP慢性發展。最新研究發現，低氧也可引起MMP-2表達增加，MMPs參與缺血低氧損傷和腫瘤的侵襲轉移等許多病理生理過程[21]。HIF-1α在低氧條件下對MMP-2也有調控作用。有研究應用氯化鈷模擬低氧以及降低氧分壓影響脂肪細胞，結果顯示，在低氧條件下MMP-2 mRNA表達明顯提高，在低氧環境下HIF-1α與MMP-2可能有一定的相關性[22]。另有研究發現，低氧環境下腸癌、胃癌病人MMP-2表達較正常人高，癌組織轉移能力也較正常組織高[23]。國外學者采用蛋白質印跡法、明膠酶譜等方法對纖維肉瘤組織進行定量實驗顯示，24 h后MMP-2 mRNA水平和細胞分泌作用顯著增高[24]。本文的研究結果也顯示，LP中MMP-2的表達與GLUT-1顯著相關。

有研究表明，能被HIF-1α直接誘導的基因即低氧反應基因（HRG）的啟動子或增強子有一個小于100 bp的DNA序列，可調控細胞對低氧的反應。而MMP-2的啟動子里缺乏此序列，推測HIF-1α對MMP-2的調控機制可能為間接調控[25-26]。NING 等[27]采用Western blot及酶聯免疫方法研究表明，惡性腫瘤組織GLUT-1可促進MMP-2的轉錄活性，繼而對MMP-2的表達進行正向調控。另有研究顯示，惡性腫瘤細胞中GLUT-1與MMP-2表達有顯著相關性[28]。ITO等[29]通過對8種腫瘤細胞系研究發現，GLUT-1與MMP-2在惡性腫瘤中表達量增高并有顯著相關性，在橫紋肌肉瘤中GLUT-1對MMP-2有正向調控作用并影響腫瘤細胞的侵襲力。本文研究結果顯示，GLUT-1在LP組織中的表達高于正常組織，并且與MMP-2表達呈正相關關系，提示HIF-1α可能通過GLUT-1在轉錄水平上對MMP-2進行正向調節。

綜上所述，LP皮損組織中HIF-1α、GLUT-1和 MMP-2表達均增加，并且三者之間的表達呈正相關，提示HIF-1α、GLUT-1和 MMP-2在LP的發病中有重要作用，但其具體機制尚需進一步研究。

[參考文獻]

[1]王慧，白莉. 扁平苔癬皮損中MIF，MMP-9的表達及意義[J]. 中國醫藥導報， 2010，7（33）：13-14.

[2]GRAS E， BELAIDI E， BRIANON-MARJOLLET A， et al. Endothelin-1 mediates intermittent hypoxia-induced inflammatory vascular remodeling through HIF-1 activation[J]. "Journal of Applied Physiology， 2016，120（4）：437-443.

[3]WANG Jing， LUO Hong， XIAO Yan， et al. miR-125b inhi-bits keratinocyte proliferation and promotes keratinocyte apoptosis in oral lichen planus by targeting MMP-2 expression through PI3 K/Akt/mTOR pathway[J]. "Biomedicine amp; Pharmacotherapy， 2016，80（80）：373-380.

[4]SELEIT I， BAKRY O A， AL-SHARAKY D R， et al. Evaluation of hypoxia inducible factor-1α and glucose transporter-1 expression in non melanoma skin cancer： an immunohistochemical study[J]. J Clin Diagn Res， 2017，11（6）：EC09-EC16.

[5]FUJINO M， AISHIMA S， SHINDO K， et al. Expression of glucose transporter-1 is correlated with hypoxia-inducible factor 1α and malignant potential in pancreatic neuroendocrine tumors[J]. "Oncology Letters， 2016，12（5）：3337-3343.

[6]HUANG X， HE Z， JIANG X， et al. Folic acid represses Hypoxia-induced inflammation in THP-1 cells through inhibition of the PI3K/Akt/HIF-1α pathway[J]. "PLoS One， 2016，11（3/4）：e0151553.

[7]KARAGIOTA A， KOURTI M， SIMOS G， et al. HIF-1α-derived cell-penetrating peptides inhibit ERK-dependent activation of HIF-1 and trigger apoptosis of cancer cells under hypoxia[J]. "Cell Mol Life Sci， 2019，76（4）：809-825.

[8]BALAMURUGAN K. HIF-1 at the crossroads of hypoxia， inflammation， and cancer[J]. "International Journal of Cancer. Journal International du Cancer， 2015，138（5）：1058-1066.

[9]SUMI C， OKAMOTO A， TANAKA H， et al. Suppression of mitochondrial Oxygen metabolism mediated by the transcription factor HIF-1 alleviates propofol-induced cell toxicity[J]. "Scientific Reports， 2018，8（1）：8987-8988.

[10]CHOI Y K. A positive circuit of VEGF increases Glut-1 expression by increasing HIF-1α gene expression in human retinal endothelial cells[J]. "Archives of Pharmacal Research， 2017，40（12）：1433-1442.

[11]HOSSEINPOUR S， MASHHADIABBAS F， AHSAIE M G. Diagnostic biomarkers in oral verrucous carcinoma：a systema-tic review[J]. "Pathology amp; Oncology Research， 2017，23（1）：19-32.

[12]SHEN Lifang， ZHAO Xin， ZHOU Shuihong， et al. In vivo evaluation of the effects of simultaneous inhibition of GLUT-1 and HIF-1 alpha by antisense oligodeoxynucleotides on the radiosensitivity of laryngeal carcinoma using micro F-18-FDG PET/CT[J]. "Oncotarget， 2017，8（21）：34709-34726.

[13]CANPOLAT T， ERSZ C， UUZ A， et al. GLUT-1 expression in proliferative endometrium， endometrial hyperplasia， endometrial adenocarcinoma and the relationship between GLUT-1 expression and prognostic parameters in endometrial adenocarcinoma[J]. "Turk Patoloji Dergisi， 2016，32（3）：141-147.

[14]ZHANG T B， ZHAO Y， TONG Z X， et al. Inhibition of glucose-transporter 1 （GLUT-1） expression reversed Warburg effect in gastric cancer cell MKN45[J]. "International Journal of Clinical and Experimental Medicine， 2015，8（2）：2423-2428.

[15]ADACHI N， KUBOTA Y， KOSAKA K， et al. Low-dose radiation pretreatment improves survival of human ceiling culture-derived proliferative adipocytes （ccdPAs） under hypoxia via HIF-1 alpha and MMP-2 induction[J]. "Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015，463（4）：1176-1183.

[16]MAHMOUD E D， VIVEK K P V， MAHMOUD S， et al. Hyperglycaemic impairment of PAR2-mediated vasodilation： prevention by inhibition of aortic endothelial sodium-glucose-co-transporter-2 and minimizing oxidative stress[J]. "Vascul Pharmacol， 2018，109：56-71.

[17]NEVEEN E S， FATMA M E， HALA A T， et al. Evaluation of serum levels of neurotrophin 4 and brain-derived nerve growth factor in uremic pruritus patients[J]. "Clin Cosmet Investig Dermatol， 2019，12：109-114.

[18]GLAZEWSKA EK， NICZYPORUK M， AWICKI S， et al. Therapy of psoriasis with narrowband ultraviolet-B light in-fluences plasma concentrations of MMP-2 and TIMP-2 in patients[J]. "Ther Clin Risk Manag， 2016，12：1579-1585.

[19]JING Wanga， HONG Luob， YAN Xiao， et al. miR-125b inhibits keratinocyte proliferation and promotes keratinocyte apoptosis in oral lichen planus by targeting MMP-2 expression through PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. "Biomed Pharmaco-ther， 2016，80：373-380.

[20]DEROSA G1， ROMANO D， BIANCHI L， et al. The effects of canrenone on inflammatory markers in patients with metabolic syndrome[J]. "Ann Med， 2015，47（1）：47-52.

[21]SUN L， XIE S， JI X， et al. MMP-2-responsive fluorescent nanoprobes for enhanced selectivity of tumor cell uptake and imaging[J]. "Biomaterials Science， 2018，6（10）：2619-2626.

[23]YASUDA M， MIYAZAWA M， FUJITA"M， "et al. Expression of hypoxia inducible factor-1alpha （HIF-1alpha） and glucose transporter-1 （GLUT-1） in ovarian adenocarcinomas： difference in hypoxic status depending on histological character[J]. "Oncology Reports， 2008，19（1）：111-116.

[24]LU Shuming， ZHANG Zhuqing， CHEN Meiru， et al. Silibinin inhibits the migration and invasion of human gastric cancer SGC7901 cells by downregulating MMP-2 and MMP-9 expression via the p38MAPK signaling pathway[J]. "Oncology Letters， 2017，14（6）：7577-7582.

[25]KIM S R， EOM T K， BYUN H G. Inhibitory effect of the carnosine-gallic acid syntheticpeptide on MMP-2 and MMP-9 in human fibrosarcoma HT1080 cells[J]. "Journal of PeptidScience， 2014，20（9）：716-724.

[26]AI P， SHEN B， PAN H， et al. MiR-411 suppressed vein wall fibrosis by downregulating MMP-2 via targeting HIF-1α[J]. "Journal of Thrombosis and Thrombolysis， 2018，45（2）：264-273.

[27]NING X， WANG Y， YAN W， et al. Chitin synthesis inhibitors promote liver cancer cell metastasis via interfering with hypoxia-inducible factor 1α[J]. "Chemosphere， 2018，206：231-237.

[28]X Yingying， BAO Yangyang， Hong Shui， et al. Effect on the expression of MMP-2，MT-MMP in laryngeal carcinoma Hep-2 cell line by antisense glucose transporter-1[J]. "Archives of Medical Research， 2012，43（5）：395-401.

[29]ITO H， DUXBURY M， ZINNER M J， et al. Glucose transporter-1 gene expression is associated with pancreatic cancer invasiveness and MMP-2 activity[J]. "Surgery， 2004，136（3）：548-556.

（本文編輯 黃建鄉）