散發性肥厚型心肌病MYH7基因突變位點篩查

[摘要]目的篩查肥厚型心肌病猝死者β-肌球蛋白重鏈（MYH7）基因的突變位點。方法應用聚合酶鏈反應（PCR）技術，對18例散發性肥厚型心肌?。ú±M）及20例非心肌?。▽φ战M）死者的甲醛固定心肌包埋組織，進行MYH7基因部分外顯子片段擴增，并進行克隆法測序分析。利用Blast在線數據庫進行突變位點物種間保守性分析。結果病例組中1例MYH7基因第14號外顯子發現Thr446Pro突變，1例第14號外顯子發現Phe468Leu突變，突變均位于MYH7基因的球狀頭部;對照組未見異常突變。物種間保守性分析顯示，Thr446和Phe468兩個氨基酸殘基在不同物種間高度保守。結論2例檢出MYH7基因突變位點者的病理組織纖維化程度較重，提示該兩個基因突變位點是導致肥厚型心肌病的惡性突變。

[關鍵詞]心肌病，肥厚性;心室肌球蛋白;DNA突變分析;法醫病理學

[中圖分類號]R542.2;R892[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0330-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutation sites in the MYH7 gene in patients with sudden death due to hypertrophic cardiomyopathy. MethodsFormalin-fixed paraffin-embedded myocardial samples were collected from 18 patients with sporadic hypertrophic cardiomyopathy （case group） and 20 patients without hypertrophic cardiomyopathy （control group）. PCR was used for the amplification of some exon fragments of the MYH7 gene， and the cloning method was used for sequencing. Blast online database was used to perform an interspecies conservation analysis of mutation sites. ResultsAmong the patients in the case group， one was found to have Thr446Pro mutation in exon 14 of the MYH7 gene and one was found to have Phe468Leu mutation in exon 14 of the MYH7 gene， and both mutation sites were located in the globular head of the MYH7 gene. No abnormal mutation was found in the control group. The interspecies conservation analysis revealed that the two amino acid residues of Thr446 and Phe468 were highly conserved among different species. ConclusionTwo patients with MYH7 gene mutations have a high degree of fibrosis in pathological tissue， suggesting that the two mutation sites are malignant mutations causing hypertrophic cardiomyopathy.

[KEY WORDS]cardiomyopathy， hypertrophic; ventricular myosins; DNA mutational analysis; forensic pathology

肥厚型心肌病（HCM）是心肌病中常見的一種常染色體顯性單基因遺傳病，是指排除導致心肌異常因素（如瓣膜病、高血壓）的原發性心肌病，以非對稱性心肌肥厚、左心室腔變小的心室壁肥厚或心臟質量增加為特征 [1-2]。HCM是青少年及運動員發生心源性猝死（SCD）的首要原因[3]。SCD占成年人猝死的第1位，據統計，在SCD的病因中，遺傳性心肌病占5.9%～6.2%，位列第3位[4-5]。中國成年人群HCM的患病率為1/500，但由于我國是人口大國，HCM患病總數較為龐大，且該病遺傳度高，大約60%的成年HCM病人可檢測到明確的致病基因突變，對病人及其整個家族影響較大[6]。因此，HCM基因突變研究具有重要意義。到目前為止，已經至少在27個基因突變中發現了1 600多個突變位點[7-8]。β-肌球蛋白重鏈（MYH7）基因是引起HCM的常見突變基因之一[9]。MYH7基因突變導致HCM的機制可能是因為心室肌能量供應不足，從而引起心室肌或室間隔肥厚而致病[10-13]。HCM的致病突變方式分為家族性和散發性兩種。家族性HCM發病比較集中且呈家族聚集性，因此較好排查死亡的原因[14-15]。散發性HCM約占HCM的45%，因發病個體隨機，死因確定較困難，是法醫學的研究熱點[16]。本研究對18例散發性HCM病人心肌MYH7基因的常見突變外顯子進行測序分析，篩查基因突變位點，從而為HCM的預防、精準治療及法醫明確死亡原因、確定死者身份提供理論依據。

1對象與方法

1.1研究對象

查閱青島大學附屬醫院病理科、青島市尸檢中心、青島市公安局刑警支隊技術處2006年1月—2017年12月的尸檢存檔資料，以法醫病理診斷為HCM（非高血壓性）的猝死病人18例為本研究病例組的研究對象。HCM的病理診斷標準：①心臟質量增加1～2倍，成人平均心臟質量>500 g;②室間隔顯著增厚，室間隔與左心室壁厚度比值>0.95，此為診斷HCM的主要指征;③組織學改變主要表現為心肌纖維顯著肥大，排列紊亂呈漩渦狀或簇狀，細胞核大、深染，核形不一，可呈多形性畸形;心肌間質內小血管壁增厚，管腔狹窄;心肌間質常有局灶性膠原纖維增生及纖維化改變。對照組20例為因暴力死亡的尸體解剖病例，已排除心臟肥大和心臟結構性病變。本研究獲得青島大學附屬醫院倫理道德委員會的批準。

1.2尸體解剖

所有研究對象均經系統尸體解剖檢查，并取心、肝、脾、腎、肺、腦等主要器官進行組織病理學檢查。

1.3基因組DNA提取

用石蠟切片機（LEICA RM2235）切取研究對象的甲醛固定石蠟包埋組織，利用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒（TIANGEN，離心柱型）提取心臟標本基因組DNA。

1.4聚合酶鏈反應（PCR）及產物克隆

根據NCBI GenBank中的MYH7基因序列，應用Primer blast引物設計軟件并根據含側翼內含子序列進行相應外顯子引物設計（表1）。設計的引物由上海生物工程公司合成。所用PCR擴增試劑為Premix TaqTM（EX TaqTM Version 2.0）。PCR反應體系25 μL，其內含有DNA模板2.0 μL，Premix 12.5 μL，上、下游引物各3 μmol/L，滅菌水4.5 μL。PCR擴增條件：98 ℃、10 s，55～62 ℃、30 s，72 ℃、1 min，循環35次。擴增產物由上海生物工程公司進行克隆測序。

1.5突變位點的確定及物種間保守性分析

運用Chromas程序，根據NCBI、UCSC提供的正常人MYH7基因的基因組序列來分析測序結果，確定突變位點。利用Blast在線數據庫進行突變位點物種間同源性比對，分析物種間保守性。

2結果

2.1法醫病理學檢查

本文18例散發性HCM猝死者中，男10例，女8例;年齡15～49歲，平均35歲。病例組心臟標本尸檢特點均符合HCM診斷標準。其中1例心臟質量630 g，室間隔厚度/左心室壁厚度為1.38;1例心臟質量494 g，室間隔厚度/左心室壁厚度為1.35。光鏡下這2例心肌組織切片蘇木精-伊紅染色主要表現為細胞核大、深染，細胞核形狀不一，可見多形性畸形，心肌纖維顯著肥大，排列紊亂呈漩渦狀或簇狀;Masson染色可見心肌間質局灶性膠原纖維增生及心肌纖維化改變（圖1）。結合2例死者突然猝死的臨床表現，按照HCM的法醫病理學診斷標準，從組織病理學水平明確是由HCM導致的SCD。對照組心臟標本大體觀察及組織學檢查均未見異常。

2.2基因組DNA測序及生物信息學分析

在18例無血緣關系的中國漢族散發性HCM猝死者中，其 中1例發現NM_000257.2：c. 1336T>G（Thr446Pro）突變（rs796553039），即人類MYH7基因組第1336位堿基由T轉換成G，使遺傳密碼由TGG轉變成GGG，從而使其編碼的第446位蘇氨酸（Thr）轉變為脯氨酸（Pro）（圖2A）;1例發現有NM_000257.2：c.1402T>C（Phe468Leu）突變（rs727504338），即人類MYH7基因組第1402位堿基由T轉換成C，使遺傳密碼由TTC轉變成CTC，從而使其編碼的第468位苯丙氨酸（Phe）轉變為亮氨酸（Leu）（圖2B）。上述兩個突變均位于MYH7基因的球狀頭部。對照組病例均未發現MYH7基因突變。運用BLAST在線數據庫對人、牛、猩猩、鼠、兔、狗、貓、豬的MYH7氨基酸序列進行物種間保守性分析，結果顯示Thr446和Phe468兩個氨基酸殘基在物種間均高度保守。

3討論

本研究對MYH7基因的3、8、14、16～20、22、23、26、27號外顯子進行檢測，共發現2例散發性HCM猝死者含有MYH7基因錯義突變位點，篩查到的Thr446Pro突變和Phe468Leu突變均為在國內首次發現的突變，且在ESP、OMIM、UCSC以及NCBI數據庫中均未發現此兩種核苷酸改變的報道。物種間保守性分析顯示，Thr446和Phe468兩個氨基酸殘基在不同物種間高度保守，其表達的蛋白質結構和功能發生缺陷，提示一旦發生突變將對生命活動產生重要影響。而在對照組病例中均未發現這兩種突變。

檢測出錯義突變的2例尸檢病例，其大體觀察可見心臟肥大，室間隔增厚、變硬，室間隔與左心室壁的厚度比值遠大于0.95，蘇木精-伊紅染色可見細胞核大深染、呈多形性，Masson染色可見心肌間質局灶性膠原纖維增生及心肌纖維化改變。心肌纖維化又稱為心肌鈣化，是指正常的心肌組織結構中膠原蛋白濃度明顯升高，出現膠原纖維的過量積聚或者膠原成分發生明顯改變。高血壓所致心肌肥厚的心肌纖維化程度遠低于HCM病人的心肌纖維化程度，故心肌纖維化改變是HCM病人典型的原發性病理學改變[17]。心肌細胞為不可再生細胞，一旦發生纖維組織增生，室間隔就會增厚、變硬，使心室充盈受限和舒張容量下降，導致心臟供血功能障礙，最終導致猝死的發生。

MYH7基因是第一個被確定為引起HCM的致病基因，也是HCM最常見的致病基因之一[18-20]。編碼MYH7基因外顯子全長5 808 bp，位于染色體14q12，共含有40個外顯子，其中頭部由第3～21號外顯子形成，頸部由第21～25號外顯子形成（又稱為頭-桿接合部），第25～40號外顯子則形成桿部。MYH7基因發生突變具有聚集性，好發于頭部及頭-桿接合部，其他部位突變發現較少[21-23]。

本研究發現的Thr446Pro和Phe468Leu錯義突變均發生于第14號外顯子，位于MYH7基因的球狀頭部。WALSH等[23]的研究總結了MYH7突變導致HCM的相關文獻報道，結果顯示，MYH7突變中有229種為錯義突變，占突變總數（238種）的96%;大部分致病基因突變發生在MYH7基因的球狀頭部與頸部，頭部和頸部發生的突變所致的相關疾病表型較桿部區域突變更加嚴重，這些突變集中在第5～8、13～16和19～23號外顯子，編碼肌球蛋白發揮功能的關鍵區域、肌動蛋白結合位點、肌球蛋白重鏈與輕鏈結合位點、核苷酸連接位點及兩個活性半胱氨酸連接區，突變后外顯率和猝死率均較高[24]。其中，第14號外顯子編碼的MYH7兩個半胱氨酸的連接區域，是球狀頭部的重要功能區。發生在此區域的突變還有Arg453Cys、Gly425Arg和Thr441Met，其臨床外顯率較高[25-27]，推測其致病機制可能是該區域發生的突變可使肌球蛋白S1區的ATP酶活性增強，阻礙了肌球蛋白構象的改變或者使其與肌動蛋白及其他分子之間的相互作用發生了改變，最終導致HCM的發生，表現為高外顯率、進展快、易致心力衰竭等惡性臨床表現[23]。結合上述研究，我們認為本實驗發現的兩個突變位點造成氨基酸的改變不是單核苷酸多態性，而是HCM的致病突變。

HCM的臨床診斷是基于對心臟肥大的檢測，它既不特異也不敏感，DNA測序技術的出現則為HCM的診斷提供了新的方向，特別是在早期診斷和獨立的臨床表型方面[20，28]。基因篩查中僅有一半的概率能夠檢測到突變基因，這表明仍然有很多與HCM相關的突變基因未被識別。先證者有時可能攜帶兩個致病的突變，但基因篩查僅篩查出其中一個，或者基因突變是從頭突變，這樣會影響到基因檢測的結果。因此，需要進行大樣本的基因檢測與臨床表型分析，為HCM防治策略的制定提供充分的依據[29]。

在法醫學中，大部分SCD案例通過尸體解剖、組織病理學檢查可以明確死因為心源性疾病，尚有少數案例雖經詳細檢驗并高度懷疑為SCD，但仍不能明確死因是心臟疾病。隨著現代分子生物學技術的發展，發現此類猝死者中有相當一部分為HCM所致，因此，研究HCM基因突變位點，可以為法醫學實踐中SCD原因的鑒定提供指導。本研究發現的MYH7基因Thr446Pro和Phe468Leu突變是國內最早發現的，可以引起HCM。散發性HCM也應警惕其將突變傳遞給下一代的風險，因此對散發性HCM病人進行家系排查同樣具有重要意義。基因檢測有助于HCM的診斷，不僅能為法醫學明確死亡原因，還能提高猝死的防治水平。

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（本文編輯 馬偉平）