靶向肝癌細胞HepG2和SMMC-7721核酸適配體的篩選及鑒定

[摘要]目的以人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721作為混合靶標篩選獲得特異性核酸適配體并對其進行鑒定。方法以HepG2和SMMC-7721兩種人源肝癌細胞為篩選混合靶標，利用細胞指數富集的配基系統進化（Cell-SELEX）技術篩選獲得核酸適配體。利用流式細胞術檢測文庫富集情況，將富集文庫進行克隆、測序，應用RNA structure、MEME在線軟件進行序列分析，再次通過流式細胞術鑒定核酸適配體與靶標的結合能力及特異性。結果通過10輪Cell-SELEX篩選得到核酸適配體10-8，流式細胞術檢測顯示核酸適配體10-8與人源肝癌細胞系HepG2和SMMC-7721細胞結合，且特異性靶向肝癌細胞。結論篩選獲得與人源肝癌細胞系HepG2 和SMMC-7721雙靶標特異性結合的核酸適配體10-8。

[關鍵詞]細胞指數富集的配基系統進化技術;癌，肝細胞;分子靶向治療;適體，核苷

[中圖分類號]R34[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0303-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo perform the screening and identification of specific aptamers targeting both HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. MethodsCell-SELEX was used to screen out the aptamers targeting both human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. Flow cytometry was used to evaluate the enrichment of pools， and the enriched pool was then cloned and sequenced. RNA structure and MEME online software were used for sequence analysis， and flow cytometry was used to identify the binding capacity and specificity of candidate aptamers to targets. ResultsThe aptamer 10-8 was obtained after 10 rounds of Cell-SELEX. Flow cytometry showed that the aptamer 10-8 was bound to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cell lines and specifically targeted hepatoma cells. ConclusionThe aptamer 10-8 specifically binding to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells is obtained.

[KEY WORDS]Cell-SELEX; carcinoma， hepatocellular; molecular targeted therapy; aptamers， nucleotide

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥死亡的主要原因之一，對人類健康和生命構成極大威脅[1-2]。據全球癌癥數據調查顯示，中國肝癌病人數約占全球的50%[3-4]，肝細胞癌占原發性肝癌的70%～90%[5]。目前，肝癌治療的方法主要為手術切除、放療、化療以及幾種治療方法的聯合治療[6-7]。手術切除不徹底、復發率高和轉移率高等是影響肝癌治療效果的主要問題[8-9]。因此，從分子水平上發展分子靶向藥物及免疫治療藥物，可以大大提高肝癌病人的治療效果[10-11]。核酸適配體是一類具有特定結構的單鏈DNA或RNA，其長度一般為20～80個堿基[12-13]。利用指數富集的配基系統進化（SELEX）技術，可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出與靶標特異性結合的核酸適配體[14]，而Cell-SELEX是在SELEX基礎上發展而來，以細胞為靶標篩選獲得核酸適配體的技術[15]。核酸適配體與抗體作用相似，但又優于抗體[16]。高特異性、高親和力的適配體具有靶分子范圍廣、性質穩定、制備方便、無免疫原性、成本低、便于保存運輸、易在體外化學合成等優點[17-19]，為惡性腫瘤的早期診斷和治療、腫瘤標志物的篩選提供了一種全新有效的方法和手段[20]。目前，以肝癌細胞為靶標進行的適配體篩選均是以單一的某一種肝癌細胞為靶標，尚未見以兩種或多種細胞為靶標進行的適配體篩選的報道。本研究以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細胞作為混合靶標，應用Cell-SELEX技術篩選特異性核酸適配體，期望獲得能靶向兩種肝癌細胞的核酸適配體，從而建立獲得廣泛靶向肝癌細胞靶標的方法。同時，本文自適配體篩選第4輪結束后引入人源永生化正常肝細胞系L-02進行消減篩選，排除適配體對正常細胞的影響，為后期通過適配體載藥進行肝癌的基因治療時，更有效地減小毒副作用、提高腫瘤部位的局部藥物濃度奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞篩選靶細胞采用人源肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721（青島大學附屬醫院中心實驗室提供）;消減篩選細胞為人源永生化正常肝細胞系L-02（購自中國科學院上海細胞庫）;特異性檢測細胞包括人源永生化乳腺細胞系HBL100、人源乳癌細胞MCF-7、人源大細胞性肺癌細胞H460、人結直腸腺癌細胞SW480及人源胃癌細胞MGC-803（青島大學附屬醫院中心實驗室提供）。以上細胞均采用含體積分數0.10胎牛血清（美國Gibco公司）的高糖DMEM培養基（美國Hyclone公司）培養。

1.1.2文庫及引物初始文庫Gp30，由兩端的固定序列和中間30個nt的隨機序列組成，其中Pstemloop-tgatt劃線部分序列可形成發卡結構，與Plong-1 tgtc引物在PCR過程中阻止正鏈延伸，可產生不等長PCR產物[21]，從而制備單鏈次級文庫投入下一輪篩選。Plong-1 tgtc與P11-tgatt用于擴增雙鏈產物，便于富集文庫克隆至pGM-T質粒載體測序獲得單克隆序列。見表1。以上文庫、引物及FAM標記適配體序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成、修飾。

1.2方法

1.2.1Cell-SELEX篩選ssDNA文庫（原始文庫或次級文庫）100 ℃變性5 min，立即冰浴10 min。加入篩選緩沖液各組分，最終孵育體系內含有：1×PBS、1 mmol/L濃度MgCl2、0.1 g/L的酵母tRNA、0.1 g/L鮭魚精DNA和所需要的ssDNA文庫。將預先處理好的ssDNA文庫加入接種于96孔板的靶細胞（HepG2或SMMC-7721，每隔兩輪更換靶細胞，兩種靶細胞交替使用），4 ℃孵育30 min;吸棄上清，篩選洗滌緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）輕柔洗滌3～4次;加入洗脫液（100 ℃雙蒸水），對結合在靶細胞上的ssDNA進行洗脫;以洗脫液作為模板，利用Plong-1 tgtc和Pstemloop-tgatt進行不等長PCR擴增。完成4輪篩選之后，從第5輪引入消減篩選，在與靶細胞進行篩選之前將孵育體系與消減細胞L-02在4 ℃孵育20 min，除去與L-02結合的適配體，將其余未結合的文庫與靶細胞孵育，進行第5輪篩選。

1.2.2PCR擴增條件優化PCR體系100 μL，內含：10×PCR反應緩沖液10 μL，dNTP混合物（每種核苷酸2.5 mmol/L）8 μL，Plong-1（25 μmol/L）1 μL，Pstemloop-3（25 μmol/L）1 μL，Taq DNA聚合酶（2.5×106 U/L）1 μL。加入2～3 μL洗脫液作為模板，為獲得雙鏈不等長的產物，采用莖環引物;為防止延伸階段莖環打開，設置PCR反應條件為：94 ℃、30 s，45 ℃、30 s，58 ℃、30 s。自12個循環數開始至40個循環結束，每隔3個循環取10 μL產物，應用含7 mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，選取非特異性擴增少、產物量剛達到平臺期的循環數作為大量擴增的條件。

1.2.3ssDNA次級文庫的制備應用含7 mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后將正確大小的ssDNA條帶切膠，置于1.5 mL的EP管中。每管加入400 μL的凝膠洗脫液（其內含有0.5 mol/L NH4AC，2 g/L SDS，1 mmol/L EDTA），37 ℃搖床上洗脫6 h以上。將凝膠洗脫液轉移到新管，加入1 mol/L MgCl2 4 μL、3 mol/L醋酸鈉（pH值5.2）40 μL和預冷的無水乙醇1 mL，混勻，于-70 ℃沉淀過夜。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清;用預冷的體積分數0.75乙醇1 mL洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心30 min;棄上清，自然晾干。雙蒸水逐管潤洗回收ssDNA（回收的ssDNA使用 NanoDrop進行質量鑒定后投入次輪篩選）。

1.2.4克隆與測序將經過10輪篩選的適配體文庫擴增為雙鏈后連接T載體，轉化至感受態E.coil DH5α中，隨機挑取60個適配體進行克隆測序。運用RNA structure軟件進行二級結構繪圖并且通過MEME在線軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）進行結構同源性分析。選擇具有代表性的序列并進行FAM標記，與靶標孵育后通過流式細胞術鑒定序列對靶標進行識別，最終篩選獲得適配體序列。

1.2.5流式細胞術鑒定富集文庫將肝癌細胞HepG2用DMEM洗去死細胞，胰酶消化，離心，篩選洗滌緩沖液重懸，然后分別與用FAM標記的引物Plong-1 tgtc擴增獲得FAM標記的第6輪、8輪、10輪文庫，4 ℃避光孵育10 min，離心后加入200 μL篩選洗滌緩沖液重懸。流式細胞儀檢測不同輪數文庫中可以結合靶標的適配體富集程度。

1.2.6適配體10-8與篩選細胞結合鑒定應用流式細胞術驗證獲得的適配體與篩選細胞（靶細胞與消減細胞）的結合情況。同時以FAM標記的原適配體庫Gp30作為對照，分別比較獲得的適配體、Gp30與不同細胞結合的熒光強度。

1.2.7獲得的適配體的特異性檢驗核酸適配體對靶標的特異性識別能力是其作為特異性分子識別探針的關鍵，因此本文檢測了獲得的適配體分別與多種不同細胞的結合情況。獲得的適配體分別與多種不同細胞系（人源永生化乳腺細胞系HBL100、人源乳癌細胞MCF-7、人源大細胞性肺癌細胞H460、人源胃癌細胞MGC-803、人源腸腺癌細胞SW480）孵育后，用流式細胞術檢測結合情況。同時用非靶細胞的人源肝癌細胞HCC-LM3進行特異性鑒定。

2結果

2.1文庫富集程度

為鑒定文庫富集情況，利用FAM標記引物擴增、回收得到FAM標記的第6輪、8輪、10輪次級文庫。以FAM標記的原適配體文庫Gp30作為對照，分別與HepG2孵育，通過流式細胞術檢測第6輪、8輪、10輪次級文庫與靶細胞的結合。結果顯示，與原適配體文庫Gp30相比，第6輪、8輪、10輪次級文庫峰值右移，熒光強度增強，顯示篩選至第6輪文庫已有一定程度富集，第10輪文庫得到進一步富集（圖1）。

2.2Cell-SELEX篩選

利用Cell-SELEX篩選最終獲得適配體序列10-8，運用RNA Structure 4.6軟件預測得到的其二級結構見圖2。

2.3適配體10-8與篩選細胞結合鑒定

流式細胞術結果顯示，適配體10-8與肝癌細胞HepG2、SMMC-7721結合的熒光強度明顯比原適配體文庫Gp30強，波峰右移。人源永生化正常肝細胞系L-02細胞與適配體10-8及原適配體文庫Gp30結合的熒光強度擬合曲線中，適配體10-8與原適配體文庫的熒光強度接近，波峰重疊，沒有明顯差異（圖3）。

2.4適配體的特異性

以細胞與核酸適配體孵育后產生的熒光超出閾值的百分比判斷核酸適配體與細胞的作用。結果顯示，與靶標人源肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721相比，適配體10-8與其他腫瘤細胞孵育后不結合，與非靶標細胞的人源肝癌細胞HCC-LM3弱結合，表明篩選所得適配體10-8具有高特異性。見表2。

3討論

肝癌的早期診斷和精準治療對提高病人生存率具有重要意義，通過分子生物學的方法尋找特異識別肝癌細胞的適配體對于肝癌的早期診斷和靶向治療至關重要。以往的靶向肝癌細胞的適配體篩選都是以單一的某一種肝癌細胞為靶細胞[22-24]，本研究期望獲得能夠普遍靶向多種肝癌細胞的適配體，以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細胞作為混合靶細胞。HepG2細胞是經典的、國際上公認的肝癌細胞[25]，但裸鼠成瘤性稍差[26];SMMC-7721細胞為國內建系細胞，成瘤性稍強[27-28]。從創新性和后期實用性的角度出發，本課題組應用Cell-SELEX技術首次以HepG2和SMMC-7721兩種肝癌細胞為混合靶標進行特異性篩選，并以永生化的人源正常肝細胞系L-02細胞進行消減篩選。

Cell-SELEX是在未知靶物質的情況下，篩選出特異性識別細胞的適配體。本文研究以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細胞每隔兩輪交替作為靶細胞篩選特異性適配體，經過10輪篩選得到富集文庫，經過克隆、測序得到60條單一適配體序列，運用RNA Structure軟件進行二級結構預測并且通過MEME軟件進行結構同源性分析，適配體序列的二級結構以莖環結構為主，且不同序列的莖環數目存在較大差異，莖環位置及大小也各不同，推測這樣的結構是適配體與靶標結合的結構基礎[29-30]。從測序的60條單一序列中選擇10條具有代表性的序列進行FAM標記，通過流式細胞術進行結合鑒定。同時，為降低非特異性適配體，在第4輪后引入消減細胞人源正常肝細胞系L-02。此外，進行PCR反應條件優化對整個篩選過程至關重要，PCR擴增的循環數多會增加非特異性擴增。本研究篩選獲得一條適配體10-8，可以特異性識別HepG2和SMMC-7721兩種人源肝癌細胞，且不與消減細胞L-02結合。此外，對適配體10-8進行種屬特異性鑒定發現，該適配體不與人源永生化乳腺細胞系HBL100、人源乳癌細胞MCF-7、人源大細胞性肺癌細胞H460以及人源結腸腺癌細胞SW480特異性結合，與人源胃癌細胞MGC-803結合弱，說明該適配體具有良好的細胞種屬特異性。將適配體10-8與另一種非靶細胞的人源肝癌細胞HCC-LM3進行結合鑒定發現，該適配體也可以特異性識別HCC-LM3細胞。

目前，尚未見以兩種或多種細胞為靶標進行的適配體篩選的報道，本研究以兩種肝癌細胞作為混合靶標，篩選獲得特異性核酸適配體10-8。由此，我們認為適配體10-8可能是一種可特異性靶向肝癌的適配體，這對特異性檢測肝癌細胞或治療藥物靶向投遞具有參考價值。

[參考文獻]

[1]LIN Meihua， LV Duo， ZHENG Yunliang， "et al. "Downregulation of CPT2 promotes tumorigenesis and chemoresistance to cisplatin in hepatocellular carcinoma[J]. "Onco Targets and Therapy， 2018，11：3101-3110.

[2]XIE Youhua. Hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma [J]. "Adv Exp Med Biol， 2017，1018：11-21.

[3]TORRE L A， BRAY F， SIEGEL R L， "et al. "Global cancer statistics， 2012[J]. "CA-A Cancer Journal for Clinicians， 2015，65（2）：87-108.

[4]ZHANG Keming， SONG Peipei， GAO Jianjun， "et al. "Perspectives on a combined test of multi serum biomarkers in China： towards screening for and diagnosing hepatocellular carcinoma at an earlier stage[J]. "Drug Discoveries amp; Therapeutics， 2014，8（3）：102-109.

[5]TORRE L A， SIEGEL R L， WARD E M， "et al. "Global cancer incidence and mortality rates and trends-An update[J]. "Can-cer Epidemiology， Biomarkers amp; Prevention： a Publication of the American Association for Cancer Research， Cosponsored by the American Society of Preventive Oncology， 2016，25（1）：16-27.

[6]AERTS M， BENTEYN D， VAN VLIERBERGHE H A， "et al. "Current status and perspectives of immune-based therapies for hepatocellular carcinoma[J]. "World Journal of Gastroente-rology， 2016，22（1）：253-261.

[7]DALTON-FITZGERALD E， TIRO J， KANDUNOORI P A， "et al. "Practice patterns and attitudes of primary care providers and barriers to surveillance of hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis[J]. "Clinical Gastroenterology and Hepatology， 2015，13（4）：791.

[8]MATSUDA T， SAIKA K. Trends in liver cancer mortality rates in Japan， USA， UK， France and Korea based on the WHO mortality database[J]. "Japanese Journal of Clinical Oncology， 2012，42（4）：360-361.

[9]SINTRA S N， TOME L， CIPRIANO M A， "et al. "Long-term outcome of the first 150 liver transplant recipients： a single-center experience[J]. "Transplantation Proceedings， 2013，45（3）：1119-1121.

[10]BRUIX J， GORES G J， MAZZAFERRO V. Hepatocellular carcinoma： clinical frontiers and perspectives[J]. "Gut， 2014，63（5）：844-855.

[11]BRUIX J， HAN K H， GORES G， "et al. "Liver cancer： approaching a personalized care[J]. "Journal of Hepatology， 2015，62（1）：S144-S156.

[12]SUN Hongguang， ZU Youli. A highlight of recent advances in aptamer technology and its application[J]. "Molecules， 2015，20（7）：11959-11980.

[13]ALSINA D， PURROY R， ROS J， "et al. "Iron in friedreich ataxia： a central role in the pathophysiology or an epiphenomenon[J]？ Pharmaceuticals， 2018，11（3）：89.

[14]李保玉，劉家云，屈園利，等. SELEX技術篩選纖維蛋白適配子的研究[J]. "現代生物醫學進展， 2015，15（11）：2037-2041.

[15]堵玉林，莫柳婷，易婭莎，等. 基于Cell-SELEX的核酸適配體在生化分析與生物成像中的應用[J]. "分析化學， 2017，45（12）：253-282.

[16]JAYASENA S D. Aptamers： an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics[J]. "Clinical Chemistry， 1999，45（9）：1628-1650.

[17]YAN A C， BELL K M， BREEDEN M M， "et al. "Aptamers： prospects in therapeutics and biomedicine[J]. "Frontiers in Bioscience： a Journal and Virtual Library， 2005，10（2）：1802-1827.

[18]WANG Lijun， WANG Ronghui， WEI Hua， "et al. "Selection of aptamers against pathogenic bacteria and their diagnostics application[J]. "World Journal of Microbiology amp; Biotechnology， 2018，34（10）：149-160.

[19]高國生，劉興暉. 指數級富集配體的系統進化技術篩選高轉移肝癌細胞HCCLM3的ssDNA適配子[J]. "中國衛生檢驗雜志， 2017，27（2）：160-162.

[20]FANG Xiaohong， TAN Weihong. Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine： a chemical biology approach[J]. "Accounts of Chemical Research， 2010，43（1）：48-57.

[21]CAO Xiaoxiao， LI Shaohua， CHEN Liucun， "et al. "Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus[J]. "Nucleic Acids Research， 2009，37（14）：4621-4628.

[22]CIVIT L， TAGHDISI S M， JONCZYK A， "et al. "Systematic evaluation of cell-SELEX enriched aptamers binding to breast cancer cells[J]. "Biochimie， 2018，145（145）：53-62.

[23]LIU Zhongbing， SUN Xiaoduan， XIAO Shuangli， "et al. "Cha-racterization of aptamer-mediated gene delivery system for li-ver cancer therapy[J]. "Oncotarget， 2018，9（6）：6830-6840.

[24]周文虎，丁勁松. 核酸適配體在抗腫瘤藥物主動靶向傳遞中的應用[J]. "中國醫藥工業雜志， 2012，43（6）：490-496.

[25]CHENG Ke， "CHEN Zhi， LIU Lian， "et al. "ZNF667 serves as a putative oncogene in human hepatocellular carcinoma[J]. "Cellular Physiology amp; Biochemistry， 2017，41：2523-2533.

[26]ZHANG Zhilei， LIU Guangchao， PENG Li， "et al. "Effect of PAK1 gene silencing on proliferation and apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines MHCC97-H and HepG2 and cells in xenograft tumor[J]. "Gene Therapy， 2018，25（4）：284-296.

[27]邵俊斌，陳智. 肝癌細胞株中腫瘤特異性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表達的研究[J]. "中華肝臟病雜志， 2003，11（3）：15-17.

[28]SUN Liang， LI Pibao， YAO Yanfen， "et al. "Proteinase-activated receptor 2 promotes tumor cell proliferation and metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition and predicts poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. "World Journal of Gastroenterology， 2018，24（10）：1120-1133.

[29]JHAVERI S D， KIRBY R， CONRAD R， "et al. "Designed signaling aptamers that transduce molecular recognition to changes in fluorescence intensity[J]. "Journal of the American Chemical Society， 2000，122（11）：2469-2473.

[30]黃博，彭磊，王帥，等. SELEX技術篩選變形鏈球菌UA159適配子可行性的研究[J]. "現代生物醫學進展， 2012，12（21）：4001-4005.

（本文編輯 黃建鄉）