AngⅡ上調TRPC6、NFAT2介導2型糖尿病腎病 足細胞損傷

[摘要]目的探討瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）、活化T細胞核因子2（NFAT2）參與血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）介導的2型糖尿病腎病足細胞損傷的可能機制。方法制備2型糖尿病大鼠模型，隨機分為糖尿病組（DM組，n=11）、纈沙坦組（ARB組，n=11），同時設置正常對照組（NC組，n=10），ARB組給予纈沙坦40 mg/（kg·d）灌胃，DM組及NC組給予等量生理鹽水灌胃，干預12周后檢測各組尿清蛋白排泄率（UAE），光鏡、電鏡下觀察腎臟及足細胞病理改變，Western blot方法測定AngⅡ、NFAT2及TRPC6蛋白的表達水平。結果DM組UAE顯著高于NC組（F=261.834，t=22.80，P<0.01），ARB組UAE水平顯著低于DM組（t=13.08，Plt;0.01）。光鏡下可見，DM組較NC組腎小球體積增大、腎基底膜增厚、系膜細胞及系膜基質增生;電鏡下可見，DM組足細胞數量減少，足突融合、消失，ARB組上述病變較DM組明顯減輕。與NC組相比，DM組AngⅡ、NFAT2、TRPC6蛋白表達水平均顯著升高（F=290.888～639.364，t=15.00～29.50，P<0.01），ARB組較DM組明顯減低（t=22.81～34.01，P<0.01）。結論AngⅡ可能通過上調TRPC6、NFAT2介導2型糖尿病足細胞損傷。

[關鍵詞]糖尿病腎病;足細胞;血管緊張素Ⅱ;TRPC陽離子通道;NFATC轉錄因子類

[中圖分類號]R587.24[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0299-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the possible mechanism of transient receptor potential cation channel 6 （TRPC6） and nuclear factor of activated T-cells 2 （NFAT2） in podocyte injury mediated by angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in type 2 diabetic nephropathy. MethodsA rat model of type 2 diabetes was established， and then these rats were randomly divided into diabetes mellitus （DM） group with 11 rats and valsartan group （ARB group） with 11 rats. A total of 10 normal rats were enrolled as normal control group （NC group）. The rats in the ARB group were given valsartan 40 mg/（kg·d） by gavage， and those in the DM group and the NC group were given an equal volume of normal saline by gavage. After 12 weeks of intervention， urinary albumin excretion （UAE） rate was measured; pathological changes of the kidney and podocytes were observed under a light microscope and an electron microscope; Western blot was used to measure the protein expression of AngⅡ， NFAT2， and TRPC6. ResultsThe DM group had a significantly higher level of UAE than the NC group （F=261.834，t=22.80，Plt;0.01）， and the ARB group had a significantly lower level of UAE than the DM group （t=13.08，Plt;0.01）. Compared with the NC group under a light microscope， the DM group had significant increases in glomerular volume and glomerular basement membrane thickness， with marked proliferation of mesangial cells and mesangial matrix; compared with the NC group under an electron microscope， the DM group had a significant reduction in the number of podocytes， with foot process fusion and disappearance. The ARB group had significantly lower severities of the above pathological changes than the DM group. Compared with the NC group， the DM group had significant increases in the protein expression of AngⅡ， NFAT2， and TRPC6 （F=290.888-639.364，t=15.00-29.50，Plt;0.01）， and the ARB group had significantly lower expression than the DM group （t=22.81-34.01，Plt;0.01）. ConclusionAngⅡ may mediate podocyte injury in type 2 diabetes by upregulating TRPC6 and NFAT2.

[KEY WORDS]diabetic nephropathies; podocytes; angiotensin Ⅱ; TRPC6 cation channel; NFATC transcription factors

目前，糖尿病腎病（DN）已經成為終末期腎臟?。‥SRD）的主要原因之一[1]，而足細胞損傷與其發生發展有密切相關性[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統的激活在足細胞損傷中有重要的作用，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）在高糖刺激的足細胞中表達明顯增多[3]。此外，瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）、活化T細胞核因子2（NFAT2）也參與了DN足細胞損傷[4-5]。足細胞實驗發現，AngⅡ可通過調控TRPC6、NFAT2表達介導足細胞損傷[3，6]，但目前少有體內實驗證實此通路，且其具體機制尚不明確。本課題擬通過動物實驗證實AngⅡ是否通過影響TRPC6、NFAT2表達促進DN足細胞損傷，并進一步探討可能的機制。

1材料及方法

1.1動物分組及處理

SPF級、體質量（200±20）g、8周齡雄性Wistar大鼠40只（青島市藥檢所實驗動物中心），隨機分為正常對照組（n=10）及實驗組（n=30）。實驗組參照文獻方法[7]建立2型糖尿病（T2DM）大鼠模型，22只大鼠建模成功，成功率73.3%。將T2DM模型大鼠隨機分為2組，各11例。纈沙坦組（ARB組）給予纈沙坦40 mg/（kg·d）灌胃，糖尿病組（DM組）給予等量生理鹽水灌胃，干預12周。

1.2生化指標檢測

干預12周后測定大鼠體質量，測鼠尾血壓（SBP），收集鼠尾靜脈血，代謝籠收集24 h尿液標本，處死大鼠，收集腎臟標本，測定空腹血糖（FBG）、膽固醇（CH）、三酰甘油（TG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿清蛋白排泄率（UAE）、尿肌酐（Ucr），計算內生肌酐清除率（Ccr=Ucr/Scr×24 h尿量）、腎小球指數（腎質量/體質量，KW/BW）、胰島素敏感指數（ISI，ISI=22.5/（FBG×FINs），HOMA法）。

1.3腎臟病理學觀察

應用40 g/L多聚甲醛固定腎組織，經脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理學變化。用25 g/L戊二醛固定腎組織，脫水、包埋、切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡（JEM-1200）下觀察足細胞超微結構的變化。

1.4Western blot方法檢測AngⅡ、NFAT2及TRPC6的表達

裂解腎皮質、提取總蛋白，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉，加入AngⅡ（兔抗鼠，1∶1 000）、TRPC6（羊抗鼠，1∶500）、NFAT（鼠抗鼠，1∶2 000）抗體及及內參GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜后加入二抗常溫孵育。應用化學發光凝膠成像系統進行AngⅡ、NFAT2及TRPC6蛋白顯色的吸光度值分析。

1.5統計學分析

應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以±s形式表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠生化指標比較

DM組大鼠FBG、TG、CH、Ccr、SBP、UAE、KW/BW均高于NC組（F=63.340～1 871.388，t=10.38～54.59，Plt;0.01），DM組ISI顯著低于DM組（F=449.825，t=26.57，P<0.01）。ARB組大鼠FBG、KW/BW、UAE與DM組比較均明顯降低（t=3.38～13.08，Plt;0.01）。見表1。

2.2各組腎臟病理表現

光鏡下觀察，NC組大鼠腎組織結構完整清晰;DM組大鼠腎小球體積明顯增大，系膜細胞及系膜基質增生，基底膜增厚;ARB組病理改變較DM組明顯減輕。

2.3足細胞超微結構

電鏡下可見，NC組足細胞結構完整清晰，足突排列整齊，基底膜均勻;DM組足細胞足突融合、消失，基底膜彌漫增厚;ARB組上述病變較DM組明顯減輕。見圖1。

2.4各組腎臟AngⅡ、TRPC6和NFAT2蛋白表達比較

DM組AngⅡ、TRPC6、NFAT2蛋白表達較NC組均明顯增加，差異有顯著性（F=290.888～639.364，t=5.00～29.50， P<0.01），ARB組較DM組明顯減低，差異有顯著性（t=22.81～34.01，P<0.01）。見圖2、表2。

3討論

DN發展過程中伴隨著足細胞數目減少及足突消失、融合等病理改變，足細胞損傷導致了蛋白尿產生[8-9]。已有研究結果顯示，足細胞損傷與自噬、巨噬細胞浸潤、氧化應激及RAS系統激活等因素密切相關[10-13]，其中腎臟局部RAS激活發揮了重要的作用[14]。DURVASULA等[15]的研究發現，高糖刺激下足細胞AngⅡ的表達明顯上調;LIN 等[16]研究顯示，1型DN大鼠腎臟AngⅡ表達增加。本文結果顯示，T2DM大鼠腎臟AngⅡ蛋白表達升高，纈沙坦干預后AngⅡ蛋白表達減少，同時UAE下降，足細胞病變緩解。由此可見，腎臟局部AngⅡ上調在DN足細胞損傷中發揮了重要的作用。AngⅡ介導足細胞損傷的機制復雜，可能與TRPC6、NFAT2相關[17-18]。

TRPC6是一種非選擇性鈣離子通道蛋白，通過介導Ca2+內流發揮作用[19-21]。足細胞中TRPC6與nephrin、podocin、CD2AP 形成裂孔隔膜（SD）復合體，共同維持足細胞結構、功能的完整性[22]。近年來有研究發現，TRPC6與DN足細胞損傷密切相關[23]。SONNEVELD等[24]體外實驗發現，高糖環境可通過刺激足細胞產生AngⅡ上調TRPC6的表達，從而促進足細胞損傷，該實驗將AngⅡ/TRPC6通路定位至足細胞。本文的研究結果顯示，DN組大鼠TRPC6表達水平較NC組上調，應用纈沙坦干預后TRPC6表達明顯減少，蛋白尿減少，足細胞病變減輕，提示在2型DN中AngⅡ可能通過上調TRPC6表達介導足細胞損傷。NFAT2是Ca2+/鈣調磷酸酶（CaN）依賴的核轉錄因子，被激活后向細胞核內移位，調控靶基因轉錄[25-26]。近年來多項研究表明，NFAT2參與糖尿病足細胞損傷。LI等[27]研究顯示，高糖刺激下細胞核內NFAT2水平顯著增加，足細胞凋亡增多，高糖促進足細胞凋亡的作用可被NFAT2拮抗劑11R-VIVIT阻斷。有動物實驗結果顯示，NFAT2在2型DN大鼠模型腎組織中的表達明顯上調[7]，本實驗結果與其一致。為進一步探討AngⅡ與NFAT2是否相互聯系、共同促進糖尿病足細胞損傷，本文應用纈沙坦拮抗AngⅡ后觀察腎臟NFAT2表達變化，結果顯示NFAT2表達較DM組明顯降低，提示2型DN中AngⅡ通過影響NFAT2的表達介導足細胞損傷。

本研究結果還顯示，DN中AngⅡ通過影響NFAT2、TRPC6表達水平促進足細胞損傷，但在該過程中NFAT2與TRPC6是否存在聯系有待進一步研究。已有研究發現，在心肌細胞中AngⅡ可通過激活TRPC6-NFAT2反饋環導致細胞肥大[28]，亦有研究證實該正反饋機制同樣存在于足細胞中[18]。具體機制可能為：AngⅡ作用于其AT1受體后，激活磷酯酶，將磷酯酰肌醇 4，5-二磷酸鹽（PIP2）水解為1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG），促進Ca2+的釋放和蛋白激酶C（PKC）的激活[29]。PKC可以進一步活化TRPC6，升高細胞內的Ca2+濃度[30]。NFAT2的激活依賴Ca2+/CaN，NFAT2被激活后發生核轉位，調控下游靶基因轉錄[31]。在以后研究中，可應用TRPC6阻斷劑干預T2DM大鼠，觀察其AngⅡ、TRPC6和NFAT2的表達，進一步探討TRPC6與NFAT2的相互作用。

總之，AngⅡ可能通過上調NFAT2、TRPC6表達參與DN足細胞損傷，為DN發病機制的研究提供了理論基礎。

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（本文編輯 黃建鄉）