單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型的建立及初步分析

[摘要]目的構建單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型。方法將KCNQ1flox/flox轉基因小鼠與特異性表達cre酶的Lyz2-cre+工具鼠進行雜交，鑒定其子代小鼠基因型，并檢測血尿酸（SUA）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）等生化指標和血清白細胞介素1β（IL-1β）水平。結果獲得KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+小鼠，其各項生化指標與野生型小鼠比較差異無顯著性（P>0.05），但血清IL-1β水平顯著降低（t=3.622，P<0.05）。結論成功構建單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型;KCNQ1可能通過對單核細胞內IL-1β的調節作用參與痛風的炎癥反應過程。

[關鍵詞]KCNQ1鉀通道;痛風;小鼠，基因敲除;模型，動物;白細胞介素1β

[中圖分類號]R-332[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0262-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo establish a mouse model of conditional knockout of the monocyte-specific KCNQ1 gene. MethodsKCNQ1flox/flox transgenic mice were hybridized with Lyz2-cre+ mice that specifically expressed cre enzyme， and then the genotypes of their offspring were identified. Meanwhile， biochemical parameters， such as serum uric acid （SUA）， fasting plasma glucose （FPG）， triglycerides （TG）， total cholesterol （TC）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， blood urea nitrogen （BUN）， and creatinine （CRE）， along with serum interleukin-1β （IL-1β） were also determined. ResultsKCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice were obtained， and there were no significant differences in biochemical parameters between the KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice and wild-type mice （Pgt;0.05）， but the KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice had a significant reduction in serum IL-1β compared with the wild-type mice （t=3.622，Plt;0.05）. ConclusionThe mouse model of conditional knockout of monocyte-specific KCNQ1 gene was successfully established. KCNQ1 may participate in the inflammatory process of gout by regulating IL-1β in monocytes.

[KEY WORDS]KCNQ1 potassium channel; gout; mice， knockout; models， animal; "interleukin-1beta

KCNQ1基因于1996年在人類遺傳性LQT綜合征中首次被發現[1]，該基因位于染色體11p15.5區，包括17個外顯子。KCNQ1基因編碼的蛋白為電壓門控性鉀離子通道KQT樣亞家族成員，在人類組織中廣泛表達[2-3]。KCNQ1和KCNE家族蛋白相互作用，裝配成功能性鉀通道，例如心肌細胞中KCNQ1/KCNE1裝配形成慢性激活延遲整流鉀通道，參與心肌細胞復極過程，胃黏膜細胞及腎小管上皮細胞中KCNQ1/KCNE2參與胃酸的分泌和水鹽代謝等重要生理作用[4-6]。因此，KCNQ1基因突變及其表達水平的變化與人類多種疾病的發生密切相關。KCNQ1基因突變會導致遺傳性LQT綜合征和家族性心房顫動，除此之外，KCNQ1基因多態性與2型糖尿病及糖尿病性腎病有關[7-9]。LI等[10]應用全基因組關聯分析（GWAS）發現，KCNQ1基因單核苷酸多態性（rs179785，G>A）與痛風發生緊密相關。王靜[11]的研究顯示，痛風病人外周血單核細胞中KCNQ1的表達水平明顯高于健康人群，提示KCNQ1可能通過影響單核細胞功能參與痛風的發病過程，但具體機制不清。為探討KCNQ1在痛風發病中的作用及其機制，本研究應用Cre-Loxp系統條件性基因敲除技術構建外周血單核細胞KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型，并對該小鼠模型的生化指標及痛風關鍵炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）的表達進行初步分析。

1材料和方法

1.1實驗動物

KCNQ1 cKO小鼠（KCNQ1flox/flox）及特異性啟動子驅動的Lyz2-cre工具鼠均購自上海南方模式生物有限公司。小鼠在青島大學附屬醫院科研實驗中心SPF級動物房內進行繁殖和實驗。小鼠養殖的環境溫度為（23±2）℃，濕度為（48±5）%，每天光照時間為12 h。小鼠飼養籠、墊料及飲用水均經過高溫高壓滅菌處理。小鼠喂以嚙齒類動物繁殖飼料，自由進食和飲水。動物實驗獲得青島大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2主要的儀器和試劑

CFX 96熒光定量PCR 儀和凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司），全自動生化分析儀（日本東芝公司），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（NEO公司），低溫超速離心機（美國SIGMA公司）。

1.3實驗方法

1.3.1獲得KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+小鼠的交配策略小鼠按雄∶雌=1∶2的比例交配。首先讓KCNQ1flox/flox小鼠與特異性表達cre酶的Lyz2-cre+工具鼠進行交配，以獲得KCNQ1flox/+/Lyz2-cre+雜合子小鼠。然后讓KCNQ1flox/+/Lyz2-cre+雜合子小鼠互相交配，鑒定和篩選后獲得基因型為KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+的單核細胞KCNQ1基因條件性敲除小鼠（KCNQ1 cKO小鼠），以同窩出生的基因型為KCNQ1+/+/Lyz2-cre-的小鼠作為野生型（WT）對照。

1.3.2子代小鼠基因型鑒定待鑒定小鼠生長至2周齡時剪取3 mm左右的鼠尾置于1.5 mL的EP管中，加入40 μL的NaOH溶液（50 mmol/L），在95 ℃金屬浴中以350 r/min離心20 min，再加入40 μL Tris HCl渦旋震蕩混勻，以12 000 r/min離心10 min，獲得基因組DNA產物，用于PCR反應。PCR反應體系為20 μL：2×Taq Plus Master Mix 1 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5 μL，含基因組DNA 的裂解產物4 μL。KCNQ1及Lyz2-cre引物由生工生物工程有限公司合成，序列見表1。KCNQ1和Lyz2-cre反應條件：94 ℃、3 min;94 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35個循環;72 ℃、5 min。取PCR擴增產物在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統觀察結果。當KCNQ1基因擴增產物僅在583 bp出現條帶時小鼠的基因型為KCNQ1flox/flox，僅在480 bp出現條帶時小鼠基因型為KCNQ1+/+，在583 bp和480 bp同時出現條帶時小鼠的基因型為KCNQ1flox/+;當Lyz2-cre基因擴增產物在700 bp出現條帶時小鼠的基因型則為Lyz2-cre+。

1.3.3KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血生化指標的檢測待KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠生長至8周齡時，各取8只，經內眥靜脈取血500 μL，然后以3 500 r/min離心10 min后獲得血清。采用全自動生化分析儀檢測兩組小鼠血尿酸（SUA）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）的水平。

1.3.4KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平檢測采用ELISA 法，按照試劑盒中提供的操作步驟進行檢測。

1.4數據處理及統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，所得計量資料數據以±s表示，KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠間血生化指標及IL-1β水平的比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1基因型鑒定

對子代小鼠基因型鑒定顯示，KCNQ1flox/flox小鼠僅在583 bp處出現條帶，而KCNQ1flox/+小鼠在583 bp和480 bp處同時出現條帶，KCNQ1+/+僅在480 bp處出現條帶;Lyz2-cre+小鼠在700 bp處出現條帶，而Lyz2-cre-小鼠在350 bp處出現條帶。其中157號小鼠的基因型為KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+，表明單核細胞特異性KCNQ1基因條件敲除小鼠模型構建成功。見圖1。

2.2KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血生化指標的比較

KCNQ1 cKO小鼠各項血生化指標與WT小鼠比較差異均無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.3KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平比較

KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平分別為（480.02±130.64）、（689.92±57.85）ng/L，KCNQ1 cKO小鼠血清IL-1β水平明顯低于WT小鼠（t=3.622，P<0.05）。

3討論

條件性基因敲除具有時間和空間可控性，可以實現體內特定種類器官或組織中的基因敲除，避免了因某些基因完全敲除所導致的胚胎死亡、發育畸形、早夭等問題[12-13]。條件性基因敲除小鼠廣泛應用于人類疾病動物模型建立及人類疾病發病機制、基因功能鑒定和表型分析等研究[14]。本研究利用條件性基因敲除技術在國際上首次實現了單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除。初步研究顯示，基因敲除小鼠發育良好，并沒有出現早期胚胎死亡、胚胎發育畸形等問題，生化指標正常。該動物模型的建立是條件性敲除技術在痛風功能基因研究領域中的一個重要應用。

KCNQ1基因位于染色體11p15.5區，所編碼的電壓門控性鉀離子通道蛋白由676個氨基酸構成，包括6個跨膜結構域和1個具有離子選擇性的p-loop結構域。KCNQ1基因廣泛表達于人類組織中，該基因的突變及表達異常與人類多種疾病的發生密切相關[2-3，15]。KCNQ1在心臟中表達水平最高，與KCNE共同形成慢性延遲整流性鉀通道，參與心臟的復極過程。KCNQ1突變會導致許多與心律失常有關的疾病，如LQT綜合征1型、JLN綜合征1型和嬰兒猝死綜合征等，猝死率高達10%～20%[7，16]。多項研究結果表明，KCNQ1基因多態性改變與2型糖尿病有關，KCNQ1危險等位基因變異影響胰島β細胞分泌功能，導致胰島素的分泌減少，影響正常的血糖調節，使2型糖尿病的發生概率增加了30%～40%[8，17]。腎臟遠曲小管分布有KCNQ1/KCNE3通道，參與K+分泌，調節機體的水電解質平衡，抑制KCNQ1基因表達會引起腎臟發育異常及濾過率降低[9]。KCNQ1在內耳、胃、胰腺等組織中也有一定的表達，KCNQ1基因突變或敲除的小鼠出現耳聾、胃腸發育異常、胰腺分泌異常等表型，但在人體中上述表型比較少見。本研究建立的單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型發育良好，未出現上述表型，各血生化指標與WT小鼠比較差異均無顯著性。分析原因可能為，該小鼠模型特異性敲除外周血單核細胞的KCNQ1基因，其心肌、胃腸、胰腺、腎臟等組織中KCNQ1基因表達正常，功能不受影響。

高尿酸血癥是痛風發病的生化基礎，臨床上有10%～20%的高尿酸血癥病人可以發展為痛風[18]。自然免疫系統被激活是高尿酸血癥導致痛風的主要機制。尿酸濃度超過其在血中的飽和度（SUA>420 μmol/L）將形成尿酸鹽結晶，沉積在關節及其周圍組織等處。尿酸鹽晶體在關節及其周圍組織的沉積，導致單核細胞趨化并吞噬尿酸鹽晶體，釋放促炎因子，這些炎性遞質會募集大量的單核細胞和中性粒細胞到達尿酸鹽晶體所在部位，放大炎癥級聯反應，引起痛風的發作[19-22]。炎性通路中任何環節的異常均可導致痛風發作。研究表明，IL-1β是痛風發病過程中具有關鍵調控功能的細胞因子，它能

3期閆飛，等. 單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型的建立及初步分析265

引起中性粒細胞遷出至滑膜和關節液中，這是急性炎癥反應的病理標志[23]。MARTIN等[24]的研究發現，尿酸鹽晶體注入踝關節引起的炎癥反應在IL-1受體敲除的小鼠中明顯降低。本文研究結果顯示，KCNQ1 cKO小鼠的血清IL-1β水平明顯低于WT小鼠，表明KCNQ1可能通過調節單核細胞中IL-1β水平參與痛風的炎癥反應過程。

綜上所述，本研究成功建立了外周血單核細胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型;初步分析KCNQ1基因可能通過影響單核細胞的炎癥反應參與痛風的發病過程，但具體機制尚不清楚。本研究為深入探討KCNQ1參與痛風發病的機制，乃至后續的痛風精準醫療和痛風治療藥物的開發奠定了基礎。

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（本文編輯 馬偉平）