幽門螺桿菌感染對功能性消化不良病兒發病的影響

[摘要]目的探討幽門螺桿菌（HP）感染對功能性消化不良（FD）病兒發病機制的影響。方法收集診斷為FD的病兒100例，確定其消化不良癥狀的嚴重程度并進行評分，行13C尿素呼氣試驗明確HP感染情況。根據HP檢測結果將病兒分為HP陽性組與HP陰性組，對HP陽性組病兒檢測其毒力因子細胞毒素相關蛋白A（CagA）抗體，根據其結果進一步分為CagA陽性組與CagA陰性組。應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測各組病兒血清中相關胃腸激素的表達水平;行胃鏡檢查時取胃黏膜組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，對胃黏膜炎癥程度進行評分并觀察炎性細胞浸潤情況;行實時熒光定量PCR檢測胃黏膜中相關炎癥因子與趨化因子mRNA的表達水平。以健康查體兒童100例作健康對照。結果FD病兒HP感染率（60%）顯著高于健康對照兒童（15%），差異有顯著性（χ2=43.2，Plt;0.01）。HP陽性組CagA陽性者占80%，與CagA陰性組、HP陰性組相比，CagA陽性組病兒的消化不良癥狀積分明顯增高（F=91.26，q=6.73、19.08，Plt;0.01），胃黏膜炎癥程度與炎性細胞浸潤亦明顯增加;血清5-羥色胺與瘦素水平明顯降低，促胃液素與胃促生長素水平明顯增高，差異均有顯著意義（F=622.35～3 724.33，q=5.29～122.04，Plt;0.01）;胃組織中炎癥因子IL-17、INF-γ與趨化因子CXCL13、CCL2的mRNA表達水平均顯著增高，差異有統計學意義（F=413.72～842.75，q=16.11～57.98，Plt;0.01）。結論HP感染可能是兒童FD的重要致病因素之一;HP感染可能通過CagA的作用影響胃腸激素的分泌與局部黏膜免疫反應而參與FD的發病。

[關鍵詞]消化不良;幽門螺桿菌;胃腸激素;趨化因子類

[中圖分類號]R725.7[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0257-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of Helicobacter pylori （HP） infection on the pathogenesis of functional dyspepsia （FD） in children. MethodsA total of 100 children diagnosed with FD were enrolled. The severity of dyspepsia was determined and scored， and the 13C-urea breath test was performed to identify HP infection. According to the results of HP detection， the children with FD were divided into HP-positive group and HP-negative group. Based on the results of cytotoxin-associated protein A （CagA） antibody detection， the children in the HP-positive group were further divided into CagA-positive group and CagA-negative group. ELISA was used to measure the expression of related gastrointestinal hormones in serum. Gastroscopy was performed to collect gastric mucosa for HE staining， the degree of gastric mucosal inflammation was determined， and the infiltration of inflammatory cells was observed. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of associated inflammatory cytokines and chemokines in gastric mucosa. A total of 100 healthy children who underwent physical examination were enrolled as healthy control group. ResultsThe children with FD had a significantly higher HP infection rate than the healthy children （60% vs 15%， χ2=43.2，Plt;0.01）. In the HP-positive group， the children with positive CagA accounted for 80%. Compared with the CagA-negative group and the HP-negative group， the CagA-positive group had a significantly higher symptom score of dyspepsia （F=91.26，q=6.73 and 19.08，Plt;0.01）， significant increases in the degree of gastric mucosal inflammation and the infiltration of inflammatory cells， significant reductions in the serum levels of 5-hydroxytryptamine "and leptin， and significant increases in the levels of gastrin and ghrelin （F=622.35-3 724.33，q=5.29-122.04，Plt;0.01）. Compared with the CagA-negative group and the HP-negative group， the CagA-positive group had significant increases in the mRNA expression of the inflammatory cytokines interleukin-17 and interferon-γ and the chemokines CXCL13 and CCL2 in gastric tissue （F=413.72-842.75，q=16.11-57.98，Plt;0.01）. ConclusionHP infection may be one of the important pathogenic factors for FD in children. HP infection may participate in the pathogenesis of FD by affecting the secretion of gastrointestinal hormones and local mucosal immune response via CagA.

[KEY WORDS]dyspepsia; Helicobacter pylori; gastrointestinal hormones; chemotactic factors

功能性消化不良（FD）是以反復發作的餐后飽脹、早飽、厭食、噯氣、惡心、嘔吐、上腹痛、上腹燒灼感或泛酸為主要表現，而經各項檢查排除器質性、系統性或代謝性疾病的一組臨床常見癥候群。FD病程有慢性、遷延性特點，難以自行緩解，嚴重影響了病人的生活質量[1-3]。在我國，成年人FD發病率為10%～30%，占消化科門診病人的40%左右[4]。雖然兒科病人中FD的發病率尚無規范統計，但FD也已成為兒科消化門診常見的就診原因[5]。FD的發病機制尚不清楚，目前認為是多因素綜合作用的結果，如胃腸運動功能障礙、內臟高敏感性、胃酸分泌異常、幽門螺桿菌（HP）感染以及精神心理因素等[6-8]。其中HP與FD關系密切，表現為FD病人HP感染率較高[9]，根除HP治療可改善部分FD病人的消化不良癥狀[10-11]。HP可能通過影響胃部炎癥反應、胃酸分泌以及胃腸激素等途徑引起FD癥狀[12-13]，但同時也有部分臨床研究的結果并不支持HP感染是FD的致病因素這一結論。HP的臨床分離株基因差異性較大，表現為明顯的基因多樣性，其中細胞毒素相關蛋白A（CagA）是HP最重要的毒力因子[14]。根據是否存在CagA，可以將HP菌株分為Ⅰ型菌株（CagA陽性）和Ⅱ型菌株（CagA陰性），Ⅰ型菌株較Ⅱ型菌株能引起更嚴重的胃黏膜損傷與炎癥，以及更高的患胃癌的概率[15]。CagA在FD發病機制中的作用需進一步研究。本研究通過分析HP感染及其抗體分型對FD病兒癥狀、血清胃腸激素、胃黏膜炎癥程度及相關炎癥因子與趨化因子表達等影響，探討HP感染在FD發病機制中的作用，以期為FD病兒臨床診治提供依據。

1對象與方法

1.1病例收集

收集2017年1—12月我院兒科門診診治的FD病兒100例，其中男38例，女62例;年齡4～14歲，平均（8.7±5.5）歲。以反復發作的餐后飽脹、早飽、厭食、惡心、嘔吐、上腹痛、上腹燒灼感或泛酸為主要表現，經各項檢查排除器質性、系統性或代謝性疾病，符合功能性胃腸病羅馬Ⅳ診斷標準[16-17]。同時選取來我院行13C尿素呼氣試驗的健康查體兒童100例作為對照。兩組兒童性別、年齡、體質量指數（BMI）差異均無統計學意義。本研究經我院倫理委員會批準，所有受試者和（或）其監護人均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2檢測指標及方法

1.2.1癥狀積分評估通過對病兒及其家屬仔細詢問，確定病兒上腹不適癥狀的嚴重程度并進行評分。評分標準：輕度（1分），不適癥狀間斷出現，不影響學習或生活;中度（2分），不適癥狀頻繁出現，一定程度上影響學習或生活;重度（3分），不適癥狀持續出現，嚴重影響了學習或生活。

1.2.2HP感染檢測采用13C尿素呼氣試驗方法。檢測前1個月停止服用質子泵抑制劑、鉍劑及抗生素等，檢測前空腹4 h以上。首先采集病兒基線呼氣標本，隨后再服用13C標記尿素，30 min后收集病兒呼氣作為測定標本。采用德國Wagner公司生產的紅外線能譜儀檢測服用尿素前后的呼氣標本，當測定標本原子豐度值大于基線呼氣標本5個百分點時，判斷為HP感染陽性。

1.2.3血清學檢查收集FD病兒空腹血4 mL，離心后獲得血清。根據13C尿素呼氣試驗結果將100例病兒分為HP陽性組和HP陰性組。取HP陽性組病兒血清，采用免疫印跡法檢測CagA抗體（試劑盒購自深圳市伯勞特生物制品有限公司，操作按試劑盒說明進行），根據CagA抗體檢測結果進一步將HP陽性組病兒分為CagA陽性組與CagA陰性組。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測FD病兒血清中5-羥色胺、促胃液素、瘦素、胃促生長素等胃腸激素水平（試劑盒購自上海晶瑩生物技術公司，操作按試劑盒說明進行）。

1.2.4胃鏡組織學檢查100例FD病兒中42例在麻醉下行胃鏡檢查，由有資質的兒科內鏡醫師進行操作。檢查時，于距幽門2～3 cm的胃竇大彎側、距賁門8 cm的胃體大彎側各取2塊組織，其中1塊用于蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察有無HP感染并請兩位病理學專家觀察其病理組織學變化及中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞的浸潤情況，依據修訂的胃炎分類與分級的悉尼系統對胃黏膜炎癥進行評分，輕、中、重度分別為1、2、3分[18]。

1.2.5胃黏膜炎癥因子檢測取胃鏡檢查獲取的胃竇與胃體組織，提取RNA，測定RNA的純度和濃度后，取1 μg的RNA進行逆轉錄反應以得到cDNA，用SYBR Green試劑盒（TaKaRa）進行實時熒光定量PCR，利用△△Ct法確定胃黏膜中炎癥因子白細胞介素17（IL-17）、干擾素（IFN）-γ、趨化因子CXCL13、CC趨化因子配體（CCL）2的mRNA相對表達水平。實驗所用引物序列見表1。

1.3統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以±s表示，兩組比較采用t檢驗;多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1FD病兒與健康兒童HP感染率的比較

FD病兒13C尿素呼氣試驗測得HP感染率為60%，顯著高于健康兒童（15%），差異有統計學意義（χ2=43.2，Plt;0.01）。HP陽性組血清CagA抗體陽性48例（80%），CagA抗體陰性12例（20%）。對各組病兒消化不良癥狀積分情況進行比較，CagA陽性組病兒消化不良癥狀最明顯，其積分明顯高于CagA陰性組與HP陰性組（F=91.26，q=6.73、19.08，χ2=7.87，Plt;0.01）;HP陰性組病兒消化不良癥狀最輕，積分低于CagA陽性組，差異有顯著性（q=5.81，Plt;0.01）。見表2。

2.2FD病兒胃鏡下表現與胃黏膜組織學變化

HE染色檢測到HP陽性FD病兒58例，其陽性率（58%）與13C尿素呼氣試驗測得的HP感染率（60%）比較，差異無顯著性（χ2=0.08，Pgt;0.05）。胃鏡下觀察顯示，HP陰性組病兒黏膜大致正常，炎性細胞浸潤較少，炎癥積分最低（F=192.33，q=27.42、13.64，χ2=14.62，Plt;0.01）;而CagA陽性組病兒可見黏膜輕度充血，散在片狀紅斑，胃黏膜炎性細胞浸潤較多，炎癥積分最高（q=4.28，Plt;0.01）。見表3。

2.3各組FD病兒血清胃腸激素水平比較

與HP陰性組相比較，CagA陰性組病兒血清中的5-羥色胺明顯增高（F=622.35，q=34.38，Plt;0.01），瘦素和胃促生長素明顯降低（F=3 724.33、688.72，q=45.23、36.54，Plt;0.01），促胃液素水平差異無統計學意義（Pgt;0.05）。CagA陽性組病兒血清中的促胃液素和胃促生長素水平均明顯高于CagA陰性組（q=52.63、5.29，Plt;0.01），5-羥色胺、瘦素水平明顯低于CagA陰性組，差異有統計學意義（q=49.39、34.83，Plt;0.01）。見表4。

2.4各組FD病兒胃黏膜炎癥因子與趨化因子mRNA表達比較

與HP陰性組比較，CagA陽性組病兒胃組織中IL-17、INF-γ、CXCL13與CCL2的mRNA表達水平明顯增高，差異有統計學意義（F=413.72～842.75，q=40.41～57.98，Plt;0.01）;CagA陽性組病兒胃組織中IL-17、INF-γ、CXCL13與CCL2的mRNA表達水平明顯高于CagA陰性組，差異亦有統計學意義（q=14.85～20.28，Plt;0.01）。見表4。

3討論

FD是一種無器質性病變發現、非潰瘍性胃腸功能性疾病，在消化不良中約占50%以上，根據不同病理生理學基礎和病人的主要癥狀，可分為餐后不適綜合征（PDS）和上腹痛綜合征（EPS）兩種亞型[4，16]。迄今為止，有關FD的病因與發病機制尚未完全明確，目前認為胃動力異常和內臟高敏感性是FD癥狀表現的重要病理生理學機制[1-2，4]。

HP感染是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等上消化道疾病的重要致病因素，也與FD的發生密切相關[4，10-13，19-20]。我國FD病人中，HP陽性者占比可達39%～87%，對此類病人進行根除HP治療有助于FD癥狀的改善。同時，國內外共識意見也明確推薦對HP陽性的FD病人進行HP根除治療[4，20]。HP長期定植于胃黏膜，可導致炎癥反應和免疫激活，使巨噬細胞、肥大細胞等在胃黏膜局部聚集，釋放炎性細胞因子作用于胃腸道平滑肌、胃腸神經系統，影響胃腸道動力和內臟感覺功能[21-22]。CagA是HP主要的致病因子，可通過機體免疫應答作用激活炎癥與腫瘤相關信號通路，最終導致胃黏膜炎癥、潰瘍或惡變。CagA的分布有地區差異性，在東亞的中國、日本和韓國，絕大部分都是CagA陽性菌株[23]。本研究結果顯示，與健康兒童相比，FD病兒的HP感染率大大增加，且CagA陽性組病兒的消化不良癥狀與胃黏膜炎癥程度均較CagA陰性組與HP陰性組嚴重，提示CagA陽性菌株定植于胃黏膜后可引起更明顯的消化不良癥狀，說明HP感染及其毒力因子的炎性致病機制可能是FD病兒產生臨床癥狀的重要原因，這也與我國HP感染率及CagA陽性率較高的現狀相符合。

相關研究表明，FD病人存在胃腸動力的異常，包括胃排空延遲、胃十二指腸運動協調失常、胃平滑肌收縮節律紊亂等，這些異常與某些胃腸激素的分泌異常有著密切關系[1，21]。5-羥色胺是一種具有多重生物學效應的腦腸肽，具有促進胃腸道運動、調節十二指腸胃反射、調控胃蛋白酶和胃酸的分泌等作用，并參與調節情感、認知、情緒、睡眠等生理活動。促胃液素可收縮胃竇和幽門括約肌，延緩胃排空，并增生修復胃腸道黏膜及增加血流量，促進胃酸、胃蛋白酶、胰液的分泌及胰島素、降鈣素的釋放。瘦素具有調節胃腸激素、延遲胃排空、保護胃腸黏膜、平衡能量代謝、抑制攝食等作用;胃促生長素則發揮增進攝食、促進胃酸分泌、促進胃腸道運動、保護胃黏膜、抑制炎癥反應等多種胃腸道生理調節作用。以上各種激素在不同分組FD病兒血清表達水平差異存在顯著性，表明HP感染及其毒力因子CagA可能通過影響胃腸激素的分泌釋放來調節胃腸運動與免疫反應，參與FD的發病與消化不良癥狀的產生。

另一方面，既往研究也證實FD病人不僅胃黏膜存在著明顯的炎性反應，其血清中炎性細胞因子水平也顯著升高，推測慢性炎癥在FD的發生、發展過程中扮演重要角色[24-25]。而HP感染導致FD的發生可能主要也是通過胃黏膜局部炎癥反應來實現的[26]。CagA可激活核因子κB（NF-κB）信號通路并誘導IL-8、TNF-α等炎癥因子表達的上調，參與黏膜炎癥反應[15]。本文研究檢測了HP陰性組、CagA陽性組、CagA陰性組FD病兒胃黏膜炎癥因子IL-17、INF-γ和趨化因子CXCL13、CCL2的mRNA表達水平，結果顯示HP感染及其毒力因子CagA可能通過上調胃黏膜相關炎癥因子與趨化因子的表達參與FD的發病過程。IL-17與INF-γ是主要由活化的T細胞產生的致炎細胞因子，可介導中性粒細胞與巨噬細胞等效應細胞的活化[27];而CXCL13、CCL2分別介導了淋巴細胞與單核細胞向炎癥部位的趨化遷移[28]，這些炎癥因子與趨化因子在黏膜表達的增加可誘導更多的炎癥細胞在HP感染的局部聚集并激活，介導黏膜炎癥與免疫反應，參與FD的發生。

綜上所述，FD病兒HP感染率較健康兒童明顯增加，其消化不良癥狀與胃黏膜炎癥反應程度、血清胃腸激素與胃黏膜炎癥因子、趨化因子的表達水平、HP感染及其毒力因子CagA密切相關，說明HP感染可能是導致兒童FD的重要致病因素之一，HP可能通過CagA的作用影響胃腸激素的分泌與局部黏膜免疫反應進而參與FD的發病，根除HP可作為治療兒童FD的有效手段之一。同時本研究也存在某些局限性，如病兒的個體差異、環境、心理因素與FD發病的關系尚不明確，今后對其進行進一步研究將有助于更好地揭示小兒FD的發病機制。

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（本文編輯 黃建鄉）