維生素C對PM2.5所致大鼠氧化損傷的影響

韓書芝 李海月 梁會朋 張鳳蕊 平芬

1河北省人民醫院老年病三科，石家莊050051；2承德醫學院附屬醫院呼吸科067000；3河北省胸科醫院結核科，石家莊050048

PM2.5(fine particulate matter 2.5)是指大氣中直徑≤2.5μm的顆粒物，由微小的固體顆粒和液滴懸浮在空氣中混合而成，與較大的大氣顆粒物相比，PM2.5粒徑小，富含大量的有毒、有害物質且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠，因而對人體健康和大氣環境質量的影響更大。PM2.5的不利影響首先表現在呼吸系統，經呼吸道吸入后，可以到達肺泡并通過氣血交換進入血液，引起肺組織及全身系統損傷。研究表明，PM2.5通過損傷呼吸道黏膜上皮細胞，部分沉積在肺泡內或肺間質內，激活肺內的免疫細胞，引起氣道炎性反應，導致呼吸系統疾病[1]。PM2.5會增加哮喘加重及呼吸道感染、肺結核、肺癌等呼吸系統疾病的發病率[2]。

本研究采集本地區大氣細顆粒物，制備PM2.5懸液，觀察PM2.5暴露及維生素C干預后大鼠血清中血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHd G)、高同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)水平的變化，探討PM2.5氧化損傷作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠32只，體質量150～200 g，均購自河北醫科大學實驗動物中心，飼養于河北省人民醫院動物房。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠32只，在動物飼養室內適應性喂養一周，自由進食、飲水，飼養溫度為22～24℃，濕度為45%～55%，晝夜節律為12 h。

隨機數字表法隨機分為4組：①空白對照組(C組，n=8)，不予處理；②生理鹽水對照組(NS組，n=8)，給予氣管插管滴生理鹽水1 ml/kg，每周1次，共4次；③PM2.5染毒組(PM2.5組，n=8)，給予氣管插管滴PM2.5(提前用生理鹽水配成7.5 g/L)1 ml/kg，每周1次，共4次；④維生素C組(VC組，n=8)，染毒同PM2.5組，實驗開始后給予10 ml/kg維生素C(用蒸餾水配成10 g/L)灌胃，1次/d，共四周。4組動物均自由進食水，于最后一次染毒24 h后處死動物，取材檢測。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，抽取5 ml腹主動脈血后處死。取右下肺組織，甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病變。血清-80℃保存待測。

1.2.2 血清MDA、8-OHd G、Hcy水平的測定采用硫代巴比妥酸法測定血清MDA水平，采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法測定血清8-OHd G、Hcy水平，操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析 應用SPSS軟件21.0版軟件進行統計學分析，結果以±s表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學評價 光鏡下觀察，空白對照組及生理鹽水對照組大鼠肺泡分布較均勻，結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤，肺泡間毛細血管無擴張充血，無間質水腫。PM2.5染毒組：大量肺泡間隔斷裂，可見明顯間質水腫，毛細血管管壁擴張，血管腔及小氣道內大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內可見出血。維生素C組：大鼠肺組織病理改變較PM2.5染毒組大鼠明顯減輕，見圖1。

2.2 大鼠血清中各指標含量的變化 空白對照組與生理鹽水對照組大鼠血清中MDA、8-OHd G、Hcy差異無統計學意義。PM2.5染毒后血清中MDA、8-OHdG、Hcy水平升高，維生素C干預組MDA、8-OHdG、Hcy水平較PM2.5染毒組低，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血清MDA、8-OHdG、Hcy水平的比較(±s)

表1 各組大鼠血清MDA、8-OHdG、Hcy水平的比較(±s)

注：C為正常對照組；NS為生理鹽水組；VC為維生素C組；PM為PM2.5組；與C比較，a P＜0.05，與NS比較，b P＜0.05，與VC比較，c P＜0.05

組別只數MDA(μmol/L)8-OHd G(μg/L)Hcy(mg/L)C 8 0.38±0.11 18.59±2.77 38.57±2.50 NS 8 0.44±0.14 20.32±2.00 40.09±3.53 VC 8 0.52±0.15a 21.16±1.53a 38.25±4.44a PM 8 0.67±0.13abc 26.73±2.81abc 43.87±3.08abc F值3.87 11.74 6.38 P值0.06 0.00 0.04

圖1 Wistar大鼠肺組織切片 HE ×200 A：正常對照組；B：生理鹽水組；C：PM2.5組；D：維生素C干預組

3 討論

隨著現代工業的發展，人類的生產、生活方式也發生了極大的變化，伴隨而來的污染問題也給人們的生命健康帶來巨大影響。空氣污染就是危害人類健康的主要影響因素之一，其中PM2.5已成為評價大氣污染的標志性污染物，已被公認為是代表性最強、危害最大的污染物，對公眾的生產、生活和健康均構成嚴重威脅[3]。目前，我國大氣PM2.5的主要來源為汽車尾氣和煤炭燃燒，主要成分有碳、有機碳化合物、硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽，其他的常見成分包括各種重金屬元素。近年來越來越多的流行病學、毒理學資料研究已證實大氣顆粒物尤其是直徑小于或等于2.5μm的顆粒物，與居民死亡和發病率的增加有關，能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統炎癥、甚至累及心血管系統、神經系統、免疫系統、促使癌癥發生，具體表現為可以導致慢性病和重病患者病死率增加，肺功能和結構發生改變，免疫系統功能下降，導致心血管系統發病率和病死率增加等[4]。

目前認為PM2.5所致肺損傷的主要機制：氧化應激、炎癥損傷、免疫損傷。各個機制之間并不是完全獨立存在的，氧化應激可導致炎性損傷，炎性損傷也可導致體內氧化/抗氧化平衡失調。

PM2.5長期吸入可以導致氣道上皮纖毛粘連、紊亂、倒伏和缺失；影響杯狀細胞和漿液細胞的分泌功能[5]；支氣管上皮細胞變性壞死，細支氣管壁增厚，大量炎癥細胞浸潤[6]。PM2.5隨空氣到達肺泡時被巨噬細胞吞噬，此過程可誘導大量促炎性因子釋放，破壞細胞因子網絡平衡，從而調節和始動肺局部炎癥反應，誘導肺部炎性損傷[7]。本組實驗結果提示：給大鼠氣管滴入PM2.5染毒后，肺組織切片可見到大量肺泡間隔斷裂，間質水腫，毛細血管擴張，支氣管壁、血管腔及小氣道內大量單核細胞，淋巴細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤，肺泡腔內可見出血。與上述研究結果相一致。

PM2.5介導的炎性細胞激活能夠引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和活性氮分子產生增加，誘導氧化應激的發生；另一方面，PM2.5可通過各種機制損害受刺激細胞的抗氧化系統并降低其抗氧化能力。有研究發現PM2.5暴露產生的ROS作為功能性信號分子，觸發核轉錄因子Nrf2易位到細胞核，從而導致抗氧化酶系統轉錄變更，可引起抗氧化酶表達改變并降低其活性。此外，PM2.5暴露產生的ROS可通過損害血脂、蛋白質和DNA等大分子的結構和功能導致靶細胞和組織的損害。

MDA是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應在機體內形成脂質過氧化物的最終降解產物。MDA含量的變化反映了體內脂質過氧化的嚴重程度。本組實驗結果顯示PM2.5可導致大鼠血清MDA含量升高，給予維生素C灌胃，血清MDA含量無明顯升高，提示PM2.5染毒后存在脂質過氧化反應，維生素C具有保護作用。8-OHdG是ROS致DNA氧化損傷的產物，實驗中常用作檢測氧化損傷、DNA突變的標志物。活性氧自由基如羥自由基、超氧陰離子等攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子時，可生成氧化性加合物8-OHdG，從而使DNA鏈空間結構改變。這種突變難以修復或修復極慢，是活性氧引起突變、誘發癌癥過程中的重要事件[8]。本組實驗結果顯示PM2.5染毒可導致大鼠血清8-OHdG含量升高，給予維生素C灌胃，血清8-OHdG無明顯升高。提示PM2.5染毒后存在DNA氧化損傷，維生素C可拮抗這種損傷。Hcy是一種含硫氨基酸，是甲硫氨基酸的中間產物，PM2.5進入機體可導致體內氧化應激增強，甲硫氨酸合成酶減少，Hcy代謝途徑受損，在體內積聚釋放至血液中[9]。Hcy代謝過程中產生大量氧化物質，其本身可干擾谷胱甘肽合成，Hcy可作為氧化劑加重肺損傷。同時，Hcy巰基氧化后超氧化物和過氧化氫的增多可引起腦組織氧化損傷[10]。實驗中觀察到PM2.5染毒可導致大鼠血清Hcy含量的升高，給予維生素C灌胃后血清Hcy含量無明顯升高。

實驗結果提示，PM2.5染毒可導致氧化損傷，維生素C對PM2.5所致的氧化損傷有一定的保護作用，其確切機制有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突