花生過(guò)敏原Ara h 1蛋白的原核表達(dá)及致敏性分析

史云鳳，張 彤，陳 沁*

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

食品過(guò)敏是指人在攝入某種食物之后產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，在醫(yī)學(xué)上屬于變態(tài)反應(yīng)的一種，可以引起身體一些組織和器官甚至全身出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)[1-2]。食品過(guò)敏在全世界都有廣泛影響，大約包括5%兒童及3%～4%成年人，并呈上升趨勢(shì)[3]。WHO/FAO認(rèn)證的8 大類(lèi)過(guò)敏食物包括花生、魚(yú)、貝類(lèi)、奶、蛋、大豆、堅(jiān)果和小麥，它們引發(fā)了約90%食物過(guò)敏反應(yīng)[4]。在這8 大類(lèi)過(guò)敏原中花生過(guò)敏因其高度危險(xiǎn)性、終身性和不可治愈性受到較大關(guān)注[5]。據(jù)調(diào)查，花生過(guò)敏在世界范圍內(nèi)都相對(duì)普遍，美國(guó)有1.1%的人對(duì)花生過(guò)敏[6]，在法國(guó)花生過(guò)敏的人數(shù)約為0.3%～0.75%[7]，丹麥有0.2%～0.4%的人群對(duì)花生過(guò)敏[8]。目前在花生中已發(fā)現(xiàn)了17 種過(guò)敏蛋白[9]，其中Ara h 1和Ara h 2被認(rèn)為是兩種最主要的過(guò)敏原，Ara h 1占花生蛋白總量的12%～16%[10]，為花生中含量最高的過(guò)敏原，與豌豆球蛋白具有高度同源性，易引發(fā)交叉反應(yīng)[11]。Shin等[12]的研究發(fā)現(xiàn)Ara h 1蛋白含有23 個(gè)抗原表位，且熱穩(wěn)定性強(qiáng)，耐酶解，故能激活樹(shù)突狀抗原提呈細(xì)胞而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。

在進(jìn)行Ara h 1過(guò)敏性研究時(shí)，從花生中提取的天然花生蛋白無(wú)疑最能體現(xiàn)其原本的致敏性，但是天然蛋白也有其不可避免的缺點(diǎn)[13]。首先在提取過(guò)程中，步驟繁多，會(huì)導(dǎo)致蛋白損失降解，活性下降；其次提取制備高純度蛋白難度較高，蛋白組分復(fù)雜對(duì)其致敏性的研究有較大影響。這些原因使得提取天然過(guò)敏原難以標(biāo)準(zhǔn)化、程序化、量產(chǎn)化。相較與提取天然過(guò)敏原，利用重組技術(shù)原核表達(dá)過(guò)敏原重組蛋白有產(chǎn)量高、易純化、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且具有與天然過(guò)敏原相似的免疫學(xué)特性，可以作為天然過(guò)敏原的代替物研究其過(guò)敏性[14]。

目前對(duì)過(guò)敏原蛋白致敏性的評(píng)價(jià)方法主要有生物信息學(xué)、血清學(xué)、模擬胃液消化、動(dòng)物模型和細(xì)胞模型五種方法[15]。其中BALB/c小鼠是最常用的過(guò)敏動(dòng)物模型。BALB/c小鼠是近交系小鼠，個(gè)體間差異較小，且BALB/c小鼠以Th2型細(xì)胞應(yīng)答為主導(dǎo)，在受到過(guò)敏原刺激后更易產(chǎn)生高應(yīng)答，所以廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究[16]。在對(duì)BALB/c小鼠致敏后，可以通過(guò)檢測(cè)小鼠組織的病理變化情況，特異性抗體、活性介質(zhì)、細(xì)胞因子的含量，以及免疫細(xì)胞形態(tài)的變化綜合評(píng)價(jià)過(guò)敏原的致敏性。Moghaddam等[17]使用BALB/c小鼠建立花生過(guò)敏模型，嘗試了多種免疫流程致敏小鼠，結(jié)果表明烘烤后花生的致敏性提高。

大鼠嗜堿性白血病（rat basophilic leukemia，RBL）細(xì)胞屬于肥大細(xì)胞系細(xì)胞，其表面有高親和力的IgE受體FcεRI，可以與IgE特異性結(jié)合處于敏化狀態(tài)，當(dāng)過(guò)敏原再次被攝入時(shí)，與致敏細(xì)胞表面相鄰的兩個(gè)或兩個(gè)以上的IgE特異性結(jié)合，使得膜表面的FcεRI交聯(lián)活化，引發(fā)了肥大細(xì)胞的脫顆粒釋放組胺、β-己糖苷酶（hexosaminidase，β-HXA）等活性介質(zhì)，在過(guò)敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[18,31]。因此在過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制研究和檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用。羅霞等[19]利用RBL-2H3細(xì)胞對(duì)幾種中藥注射液的潛在致敏性進(jìn)行探究。Sun Na等[20]在比較了兩種RBL細(xì)胞系后，選用RBL-2H3建立了過(guò)敏原鑒定和臨床診斷的細(xì)胞模型。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬用BALB/c小鼠和RBL細(xì)胞模型研究重組Ara h 1蛋白的致敏性（圖1）。

圖1 本研究擬實(shí)驗(yàn)思路圖Fig. 1 Graphic abstract of this study

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生品種為四粒紅，市售。

TRIzon 康為世紀(jì)生物科技有限公司；大腸桿菌E. coli DH5α、E. coli Rosetta（DE3）、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HindIII、SalI、T4連接酶、PrimeScript?RT Master Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA Marker（DL5000） 寶生物工程（大連）有限公司；Ni親和層析樹(shù)脂 德國(guó)Qiagen公司；高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase南京諾唯贊生物科技有限公司；HRP-羊抗兔IgG1、HRP-羊抗兔IgG2a、HRP-羊抗兔IgE 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；IL-4、IL-5、IFN-γ、組胺ELISA試劑盒 上海寶曼生物科技有限公司；氨基己糖（4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，PNAG）美國(guó)Sigma公司；其他試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNA水平電泳槽、蛋白垂直電泳槽、凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；EMax Plus單功能光吸收酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；650E超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；4530R低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；BX51光學(xué)顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 pET-28a-Ara h 1表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank已報(bào)道的花生過(guò)敏原Ara h 1的基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，在上游引物的5′端引入HindIII酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基CCC，在下游引物3′端引入S a l I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基ACGC。上游引物：5′-CCCAAGCTTCGATGGCCGTCACCCCCAG CCTGCTG-3′；下游引物：5′-ACGCGTCGACTCA G C T G C A G G A A T T T T G G C A G G-3′。使用TRIzon法提取花生總RNA，將花生子葉在液氮中充分研磨后取30～50 mg放入RNase-Free離心管中，加入1 mL TRIzon混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置2～3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，去上清液，轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，放置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入1 mL的75%乙醇溶液洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心3 min，棄上清液，放置2～3 min晾干，加入50 μL無(wú)RNase水溶解，-80 ℃保存。

用PrimeScript? RT Master Mix試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA≤500 ng，加Rnase-Free ddH2O至10 μL。37 ℃孵育15 min，85 ℃、5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

用高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），反應(yīng)體系為Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，上下游引物（10 mmol/L）2×2 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 16 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸60 s共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將目的條帶割膠回收，用HindIII和SalI雙酶切pEt-28a載體和回收條帶，用T4連接酶連接酶切后的目的基因和載體片段，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性質(zhì)粒。將陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序后用BLAST工具對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列對(duì)比分析。

1.3.2 Ara h 1蛋白的原核表達(dá)

比對(duì)成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli Rosetta（DE3）宿主表達(dá)菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm約為0.5～0.6時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)6 h。將表達(dá)完成的菌液3 000 r/min離心10 min收集細(xì)菌沉淀，將沉淀用超聲破菌緩沖液重懸后對(duì)細(xì)菌進(jìn)行破碎，超聲破碎條件為功率300 W、超聲3 s停3 s，至菌液澄清透亮為止，該溶液中的蛋白即為全菌蛋白。將超聲破碎的菌液12 000 r/min離心15 min，上清液即為上清蛋白，沉淀為包涵體蛋白。將包涵體蛋白置于包涵體溶解液中4 ℃攪拌5～8 h至無(wú)沉淀，再將溶解好的溶液置于透析袋中，放入尿素濃度依次為6 mol/L-4 mol/L-2 mol/L-1 mol/L-0 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中透析，逐步將蛋白溶液中的尿素去除，完成包涵體蛋白的溶解復(fù)性。

1.3.3 重組Ara h 1蛋白的純化及鑒定

將溶解復(fù)性的包涵體蛋白與適量的鎳離子樹(shù)脂混合，4 ℃置于旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)混勻2 h。將充分混合作用的溶液加入純化柱中，先用含30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗掉雜蛋白，再用含300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白（洗脫緩沖液體積約為鎳離子樹(shù)脂體積的3 倍，過(guò)多會(huì)稀釋目的蛋白的濃度），收集洗脫液，即為純化的重組蛋白。將重組蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠條送至基云（上海）生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.4 天然Ara h 1蛋白的純化

將花生粉碎后放入pH 7.4的Tris-HCl（1∶20（g/mL））中攪拌4 h，12 000 r/min離心30 min，取中間澄清溶液，裝入透析袋中20 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl中透析除NaCl。打開(kāi)AKTA蛋白純化儀清洗裝置，設(shè)置清洗速率2.0 mL/min，洗至平線。裝柱，洗掉DEAESepharose Fast Flow柱中乙醇，15 min洗至平線，將A1管放入20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，平衡3～5 個(gè)柱體積。上樣用一次性注射器將50 mg蛋白粗提液經(jīng)裝置進(jìn)入柱中，15 min后，用20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液洗至平線。洗脫時(shí)，將A2管放入1 mmol/L NaCl溶液中，設(shè)置每管洗脫體積4 mL，洗脫時(shí)間340 min。洗脫完成后收集0.2～0.3 mol NaCl所對(duì)應(yīng)的蛋白。最后清洗柱子，將A2管放入水中，2 mL/min清洗60 min后，將A2管放入乙醇中，20 min后取下柱子。SDS-PAGE驗(yàn)證每管收集的蛋白。

1.3.5 小鼠的致敏流程

將15 只BALB/c小鼠分為PBS對(duì)照組（5 只）、重組Ara h 1蛋白致敏組（10 只）、天然Ara h 1蛋白致敏組（10 只）。致敏方式為腹腔注射5 次，每次注射100 μL蛋白（0.1 μg/μL），每次間隔1 周。5 周后進(jìn)行大劑量激發(fā)（腹腔注射5 倍劑量），30 min后將小鼠摘眼球取血處死，取出空腸組織和肺組織，血液4 ℃沉降過(guò)夜后吸出上層血清，-20 ℃保存。

1.3.6 小鼠空腸、肺病理切片的觀察

小鼠空腸組織和肺組織，剪成適當(dāng)大小的體積，泡在體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理變化情況。

1.3.7 血液中特異性抗體與細(xì)胞因子含量的測(cè)定

將100 μL花生蛋白（0.1 mg/mL）加入96 孔板中，4 ℃包被過(guò)夜。ELISA洗液洗板（3 次，每次3 min，下同），加入200 μL 5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。ELISA洗液洗板后每孔加入200 μL稀釋1 000 倍的小鼠血清37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板，每孔加入200 μL羊抗鼠HRP-IgE（1∶1 000）/羊抗鼠HRP-IgG1（1∶10 000）/羊抗鼠HRP-IgG2a（1∶1 000）37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板后加入200 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色底物，37 ℃避光孵育15 min，最后加入50 μL終止液終止反應(yīng)，測(cè)OD450nm值。

IL-4、IL-5、IFN-γ、組胺含量的檢測(cè)方法見(jiàn)上海寶曼生物科技有限公司ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.8 RBL-2H3細(xì)胞模型對(duì)重組Ara h 1蛋白致敏性的評(píng)估

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL細(xì)胞（5×105個(gè)/mL）接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后PBS洗滌3 次，加入含有過(guò)敏血清的培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h后用Tyrode's緩沖液洗滌3 次，實(shí)驗(yàn)組加入50 μL重組Ara h 1蛋白（10 ng/mL），全部釋放組加入50 μL 1% Triton-X100，空白組加入50 μL Tyrode's緩沖液，反應(yīng)45 min后放入冰盒中終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移30 μL上清液至另一96 孔板，每孔中加入5 mmol/L PNAG-檸檬酸溶液50 μL，37 ℃孵育1 h。1 h后每孔加入200 μL碳酸氫鈉緩沖液顯色，酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm。按下式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組β-HXA的釋放率：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Ara h 1蛋白的原核表達(dá)

2.1.1 pET-28a-Ara h 1表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序

提取花生全RNA，電泳檢測(cè)其反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由圖2A可知，在2 000 bp左右有一條明亮條帶，大小與已公布的Ara h 1基因（1 845 bp）大小基本相符。將目的條帶與pET-28a載體雙酶切后連接，構(gòu)建pET-28a-Ara h 1表達(dá)載體并進(jìn)行雙酶切鑒定，由圖2B可見(jiàn)，5 000 bp左右處的條帶為pET-28a載體，2 000 bp處的條帶為Ara h 1基因。測(cè)序和BLAST工具分析顯示與已公布的Ara h 1基因序列相似度100%，表明Ara h 1基因已被成功克隆且已連接到pET-28a表達(dá)載體上。

圖2 Ara h 1基因的克隆（A）與pET-28a-Ara h 1載體（B）的雙酶切鑒定Fig. 2 Cloning of Ara h 1 gene (A) and identi fi cation of plasmid pET-28a-Ara h 1 (B)

2.1.2 重組Ara h 1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）宿主表達(dá)菌中，在16、30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，提取全菌、上清液、包涵體蛋白，SDS-PAGE分析在不同溫度下重組蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3A所示，在全菌中，30 ℃誘導(dǎo)有重組蛋白表達(dá)，16 ℃基本無(wú)表達(dá)；而在上清液中，30 ℃和16 ℃均無(wú)明顯表達(dá)；在包涵體中，30 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量高于16 ℃誘導(dǎo)，故用30 ℃為誘導(dǎo)表達(dá)條件，且重組Ara h 1蛋白以包涵體形式表達(dá)，重組蛋白大小約為75 kDa，與預(yù)計(jì)相符。將包涵體蛋白溶解后透析復(fù)性，用鎳離子吸附柱純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，SDS-PAGE的結(jié)果（圖3B）表明純化后目的蛋白條帶單一，純度較高。進(jìn)一步對(duì)重組蛋白樣品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（圖4），用MASCOT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，得分為14 994，經(jīng)鑒定重組蛋白為Ara h 1過(guò)敏原。

圖4 重組Ara h 1蛋白的鑒定Fig. 4 Identification of recombinant Ara h 1

2.2 重組Ara h 1蛋白的致敏性驗(yàn)證

2.2.1 重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏BALB/c小鼠的血清學(xué)分析

按1.3.5節(jié)致敏流程致敏小鼠，5 周后處死小鼠后取血清，測(cè)特異性抗體（IgE、IgG1、IgG2a）、細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IFN-γ）和組胺的含量。由圖5A、B可見(jiàn)，重組蛋白和天然蛋白致敏的小鼠血清中IgE、IgG含量均顯著高于PBS組小鼠，表明重組蛋白與天然蛋白一樣具有致敏性，且重組蛋白與天然蛋白相比有更高的致敏性。在兩組小鼠中IgG1滴度明顯高于IgG2a，故IgG1/IgG2a比值均大于1，表明在兩組小鼠體內(nèi)過(guò)敏反應(yīng)均為T(mén)h2型。細(xì)胞因子的測(cè)定結(jié)果（圖5C）顯示重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏的小鼠血清中Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5較PBS組有明顯升高，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)重組Ara h 1蛋白與天然蛋白類(lèi)似，可以通過(guò)上調(diào)Th2型細(xì)胞因子，下調(diào)Th1型細(xì)胞因子引發(fā)小鼠Th2型過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。另外，重組Ara h 1蛋白和天然Ara h 1蛋白致敏的小鼠血清中組胺含量都明顯升高，也證明重組Ara h 1蛋白與天然Ara h 1蛋白一樣可以引發(fā)BALB/c小鼠過(guò)敏反應(yīng)。

圖5 重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的血清學(xué)分析Fig. 5 Serological analysis of BALB/c mice sensitized to recombinant Ara h 1

2.2.2 重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的病理學(xué)分析

處死小鼠后，取空腸和肺組織，制成蘇木精-伊紅染色切片。空腸蘇木精-伊紅切片（圖6）顯示PBS組小鼠腸絨毛整齊清晰，沒(méi)有明顯損傷，腸壁平整光滑；而重組蛋白致敏小鼠的空腸出現(xiàn)了腸絨毛斷裂、腸壁破損增厚的現(xiàn)象，表明重組蛋白引起了BALB/c小鼠出現(xiàn)腸黏膜損傷和病變，提示重組Ara h 1花生蛋白可能存在一定的致敏性。

圖6 重組Ara h 1蛋白致敏小鼠的空腸病理切片F(xiàn)ig. 6 Pathological section of jejunum

由肺組織病理切片（圖7）可知，PBS組小鼠支氣管壁完整清晰，肺泡均勻完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象和充血現(xiàn)象；而在重組Ara h 1蛋白處理小鼠的肺切片中，肺支氣管、肺泡均發(fā)生不同程度的炎癥現(xiàn)象，包括小鼠肺支氣管和肺泡充血，肺支氣管破損和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。表明重組Ara h 1蛋白可導(dǎo)致小鼠肺部發(fā)生炎癥病變，進(jìn)一步說(shuō)明重組Ara h 1蛋白具有一定的致敏性。

圖7 重組Ara h 1蛋白致敏小鼠的肺泡和肺支氣管病理切片F(xiàn)ig. 7 Pathological section of lung

2.2.3 RBL細(xì)胞模型對(duì)重組Ara h 1蛋白致敏性的評(píng)價(jià)

用重組Ara h 1蛋白刺激小鼠的血清致敏RBL細(xì)胞，檢測(cè)β-HXA釋放率，由圖8可見(jiàn)，重組Ara h 1蛋白組有更高β-HXA的釋放量，RBL細(xì)胞模型進(jìn)一步確認(rèn)重組Ara h 1蛋白具有致敏性。

圖8 重組蛋白對(duì)RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HXA的影響Fig. 8 Release rate of β-HXA in RBL-2H3 cells stimulated by recombinant Ara h 1

3 討 論

花生過(guò)敏反應(yīng)是典型的由IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，對(duì)全身諸多臟器產(chǎn)生影響，可以引起面部以及喉部水腫，皮膚紅腫，血壓升高，甚至引發(fā)休克[21]。重組蛋白用于花生過(guò)敏原研究具有重要的意義[22]。重組表達(dá)系統(tǒng)主要有原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)和無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)繁殖速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高，是最常用的重組表達(dá)系統(tǒng)[23]。

但是大腸桿菌系統(tǒng)也有缺乏糖基化和磷酸化修飾、容易形成不溶的包涵體的缺點(diǎn)。pET-28a載體是最常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體，可以表達(dá)帶有His tag的融合蛋白，通過(guò)Ni離子親和純化可以簡(jiǎn)便快速地得到目的蛋白[24]。據(jù)報(bào)道，Ara h 1為最重要的花生過(guò)敏原之一，本實(shí)驗(yàn)擬探究Ara h 1蛋白對(duì)小鼠的致敏機(jī)制，故構(gòu)建了pET-28a-Ara h 1表達(dá)載體，使用Rosetta大腸肝菌原核表達(dá)重組Ara h 1蛋白，由于重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，所以采用了高濃度的尿素將其溶解后梯度透析復(fù)性的方法得到可溶性蛋白，進(jìn)行后續(xù)的研究。

動(dòng)物模型中過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，所以在判斷過(guò)敏原致敏性大小時(shí)需要綜合參考多個(gè)指標(biāo)。劉志剛等在建立花生過(guò)敏模型時(shí)觀察了空腸的病理切片，發(fā)現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)可以導(dǎo)致空腸損傷病變[25]。Zhang Wenju等[26]通過(guò)檢測(cè)不同處理的Ara h 2致敏小鼠后小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、組胺的含量來(lái)研究熱處理對(duì)花生蛋白Ara h 2致敏性影響。陳同強(qiáng)等[27]在建立龍蝦過(guò)敏小鼠模型時(shí)，主要通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠血清中IgE、組胺以及被動(dòng)皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IgE抗體滴度評(píng)價(jià)龍蝦過(guò)敏。本研究結(jié)果顯示在重組Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠后，血清中特異性抗體（IgE、IgG）水平顯著升高，且IgG1/IgG2a大于1，呈Th2型過(guò)敏反應(yīng)趨勢(shì)；Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ）無(wú)變化、Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5）水平升高驗(yàn)證并解釋了Th2型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的機(jī)理[28]；組胺釋放水平的顯著上升，進(jìn)一步證實(shí)了重組Ara h 1蛋白的致敏性；觀察了小鼠的空腸和肺切片，有明顯病變發(fā)生，推測(cè)是由于組胺及其他炎性介質(zhì)釋放導(dǎo)致。經(jīng)過(guò)與天然Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特異性抗體、細(xì)胞因子和組胺含量的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)重組Ara h 1蛋白具有與天然Ara h 1蛋白相似的致敏性，均可以引發(fā)小鼠Th2型過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。

RBL細(xì)胞模型是最常見(jiàn)的致敏原細(xì)胞評(píng)價(jià)體系，這是由于RBL-2H3細(xì)胞系功能類(lèi)似于體內(nèi)的肥大細(xì)胞，體外模擬了過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)敏階段[29]。在致敏階段，IgE與肥大細(xì)胞表面FcεRI受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，當(dāng)相應(yīng)抗原再次進(jìn)入機(jī)體后，小片段的抗原決定簇將肥大細(xì)胞表面的兩個(gè)或兩個(gè)以上的IgE特異性結(jié)合，導(dǎo)致FcεRI的交聯(lián)，引發(fā)了肥大細(xì)胞的脫顆粒，這是過(guò)敏反應(yīng)中最重要的環(huán)節(jié)。由于在RBL細(xì)胞中組胺表達(dá)量較少，且組胺半衰期較短，故通過(guò)檢測(cè)β-HXA含量判斷RBL脫顆粒水平[30-31]。本實(shí)驗(yàn)中，重組Ara h 1蛋白具有更強(qiáng)的使RBL細(xì)胞脫顆粒的能力，這與小鼠實(shí)驗(yàn)中重組蛋白致敏的小鼠血清中有大量組胺釋放的結(jié)果相互印證，更進(jìn)一步證明了重組Ara h 1蛋白存在致敏性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功重組表達(dá)了花生蛋白Ara h 1，且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證重組Ara h 1蛋白具有一定的致敏性，且與天然Ara h 1蛋白相似。