基于電化學生物傳感器檢測食源性致病菌及其毒素的研究進展

關樺楠，宋巖，龔德狀，韓博林，劉曉飛，張娜

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076）

近年來，伴隨高新分子學技術理論的更新、多功能納米材料的介入、以及高靈敏度電化學等有效手段的開發，基于電信號傳感體系的相關檢測技術也獲得了極大的發展。其原理是電化學生物傳感器的換能元件（電極），將識別到的目標物質，在電極表面形成特異性雜交，將雜交信息轉化為電流、電位、電導或電阻等特征檢測信號輸出，從而將信息轉換成可測量信號[1]。電化學傳感器具有儀器簡便、成本低廉、操作簡單、檢測快速、靈敏度高和特異性好等特點，以其智能化、微型化、便攜化的優點已發展為一種較為理想的快速檢測體系[2-3]。

目前，在傳統食源性有害微生物的檢測過程中，普遍存在著操作過程繁瑣，耗時較長，檢測靈敏度不高，檢測專一性不強，檢測成本過高的缺陷。與此同時，電化學型生物傳感器在檢測食源性致病菌的過程中，以其高特異性和高精確度，實現了低成本高效實時檢測有害微生物的目標。因此，電化學生物傳感器已成為用來鑒定和定量檢測食源性致病菌的一條有效途徑，并在食品安全監管和疾病的預防控制等方面具有廣泛的應用前景[4]。該文綜述了近年來電化學生物傳感器在檢測食源性致病菌領域的最新研究進展并對其發展方向進行展望。

1 檢測食源性致病菌及其毒素的電化學生物傳感器的分類

電化學生物傳感器是識別并轉換生物分子信息信號為電信號的一種分析檢測裝置，主要由兩部分組成：生物感受器和換能器。生物感受器識別生物分子，由具有分子識別功能的生物受體或識別靶分析物的生物識別元件構成，生物受體主要包括微生物、組織、細胞、細胞器、抗體抗原、酶、核酸等。生物受體接受對應生物響應，或識別元件識別靶分析物，通過換能器等轉換元件將其轉換為電信號，再通過信號放大元件將輸入的信號轉換為大的包含基本特征的可測量電信號，最后將擴增后的信號分析處理[5]。

檢測食源性致病菌的電化學生物傳感器以生物感受器或換能器不同類型下的各子類而分類[4-5]。按生物感受器的識別元件通常被分為四大類，主要包括抗原/抗體、酶、核酸和噬菌體；按換能器轉換信號的類型可分為：光學、電化學、質量敏感型；其中光學傳感器又可分為表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）、光纖、拉曼光譜輔助類型[6]；根據最終測量信號的不同可分為，電流型、電阻型、電導型和電位型。在實際應用中稱為電流型電化學生物傳感器、阻抗型電化學生物傳感器、電導型電化學生物傳感器、電勢型電化學生物傳感器[7]。

2 不同類型電化學生物傳感器檢測食源性致病菌及其毒素的進展

2.1 電流型生物傳感器在檢測食源性致病菌及其毒素中的應用

電流型電化學生物傳感器也被稱為安培型電化學生物傳感器，是化學傳感器最常采用的一種類型，它的檢測原理是當工作電極的電位設定在一定值時，被測物在電極表面或其修飾層內氧化還原反應產生電流，從而可以通過生成的電流隨時間的變化來定量分析生物電化學反應中的電活性物質[8]。近年來，電流型電化學生物傳感器通過制備免疫復合物或與其他免疫分離技術相結合，縮短檢測時間，降低檢測限，與傳統方法相比誤差小，具有良好的可操作性。王澤華等[9]制備了電沉積納米金修飾的16 通道電流型前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）免疫傳感器，降低了成本，簡化預處理過程，獲得良好的特異性和重現性。

在食源性致病菌檢測的應用中，郭燕等[10]為實現快速準確的檢測致奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌（S.aureus），優化培養物中葡萄糖的制備條件，研制對目標菌具有嚴格選擇性的培養基，適用于電流型葡萄糖傳感器。基于其良好的抗干擾能力和穩定性，為基層奶牛場提供快速可靠的初步診斷。在檢測黃曲霉毒素（aflatoxin B1，AFB1）的應用中，基于免疫分析方法將抗原與牛血清蛋白的結合物（bovine serum albuminaflatoxin B1，BSA-AFB1）或抗體固定在修飾電極表面，有時需要使用酶標記物堿性磷酸醋酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）[11]。在酶促反應中，常用ALP 標記二抗作為信號放大系統。待檢的游離AFB1與固定在電極表面的BSA-AFB1競爭結合抗黃曲霉毒素（antibody-afla toxin B1，anti-AFB1）抗體，ALP 催化底液1-萘基磷酸鹽產生的響應電流，電流隨AFB1濃度增大而減小。結果表明在實際操作中，大麥樣品的背景信號要大于在AFB1標準液中的信號，所以基質效應是實際樣品檢測中需要克服的問題。而釆取類似方法，使用多個電極或含有多個電極的多孔微板形成的傳感器陣列分析在實際玉米樣品中的檢測性能，開展多樣品同時在線測定，可以效率并節約成本[11]。與此同時，部分研究利用了黃曲霉毒素氧化還原酶（aflatoxin-oxidase，AFO）的催化氧化作用或黃曲霉毒素對乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的活性抑制作用，但檢測效果不理想，如果想進一步降低檢測限，提高靈敏度，必須對測試液進行預濃縮處理[12]。

Chen 等[13]研制了一種新型的基于三維石墨烯（3D G）結構的金納米顆粒修飾的電化學DNA 生物傳感器。采用自行設計的生物捕獲探針對異化亞硫酸鹽還原酶（dissimilatory sulfite reductase，DsrAB）基因進行識別，可檢測多種食源性致病菌。此類含有3D G 的金納米粒子可參與食源性致病菌的富集識別探針的構建。該類型電化學生物傳感器具有較大的比表面積，顯著提高了檢測體系的響應電流值，進而改善了檢測有害微生物體系的靈敏度，見圖1。

圖1 寡核苷酸序列電化學生物傳感器的制作原理Fig.1 Fabrication principle of oligonucleotide sequence electrochemical biosensor

由圖1可知，首先制備3D G 修飾的金米（3D GAuNPs），經超聲處理后，在分散體上與苯酚充分混合；將制備的混合物涂于玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）。基于Au 鍵和靜電相互作用，采用滴涂法將捕獲探針（capture probe，CP），與3D G-AuNPs 進行免疫交聯反應，構建修飾電極CP/3D G-AuNPs/GCE；靶標DNA 樣品與亞甲基藍（MB）相互作用并在CP/3D G-AuNPs/GCE 表面產生電流響應。在優化條件下，該傳感器靈敏度高，檢測限可達9.41×10-15mol/L。

2.2 阻抗型生物傳感器在檢測食源性致病菌及其毒素中的應用

阻抗型電化學生物傳感器主要是通過檢測電極表面發生微生物繁殖代謝轉化為電活性物質的生物識別反應引起電極表面阻值的變化來測量分析物。電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是研究傳感界面電特性并跟蹤界面反應，研究電極系統以及測定固體電解質電導率的一種電化學測量方法，可以檢測電極表面的電子傳遞阻抗，觀察生物分子間相互作用的動力學，被廣泛應用于電化學傳感器的開發[14]。電化學阻抗是一種新的電化學檢測技術，近年來開發了基于生物識別特異性來利用電化學阻抗來檢測致病菌的方法。根據電極表面固定受體的不同可以將阻抗生物傳感器分為四類，分別為免疫型、核酸型、噬菌體型和凝集素型[15-16]。

電化學阻抗技術應用于食源性致病菌的定量檢測中一般不需要標記物。基于抗原-抗體的免疫反應導致電極表面阻抗值變化的原理，Zhou 等[17]使用電沉積法制備出一種修飾在金電極表面復合物膜，將anti-AFB1抗體固定在微電極表面，可應用于病原菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）的快速檢測。而類似的檢測方法也可采用溶膠凝膠法和離子液生物相容性膜固定抗體，可以增強電極表面的導電性，提高靈敏度。核酸生物傳感器使核酸在高濃度合成過程中修飾官能團，固定在電極表面，應用于細菌檢測[18]。Kara 等[19]基于此方法檢測芽孢桿菌炭疽，靈敏度高。噬菌體生物傳感器因噬菌體可溶解細菌，特異性強，應用于細菌的檢測。Arghavan 等[20]用此方法檢測大腸桿菌，大腸桿菌濃度為102cfu/mL～108cfu/mL 時測得的阻抗值隨著細菌濃度的增大而減小，凝集素生物傳感器以凝集素為生物受體與細菌表面的單糖或多糖結合以捕獲細菌。Gamella 等[21]用阻抗免標記法檢測大腸桿菌，線性范圍為5.0×103cfu/mL～5.0×107cfu/mL。

Tokonami 等設計了一種具有代表性的基于T4 噬菌體的阻抗生物傳感器用于大腸桿菌的檢測[22]。結果表明，隨著大腸桿菌濃度的增加，電荷轉移抗性增強。既可以歸因于噬菌體修飾的細菌被束縛在表面，也可以歸因于大腸桿菌表面（帶負電）和離子氧化還原探針之間的靜電相互作用，此類型傳感器構建原理見圖2。從圖2可知，首先將巰基乙胺組裝在金電極上（A）；其次，使用1，4-二硫氰酸酯作為介質進行交聯（B）；采用乙醇胺對T4 噬菌體進行固定化和阻斷（C），捕獲大腸桿菌細胞（D），基于阻抗/線性放大雙重反應對大腸桿菌進行檢測（E）。

Hoda 等研制了一種新型的用于病毒DNA 檢測的電化學生物傳感檢測裝置，利用EIS 對試驗步驟進行了優化，確定了制備生物傳感器的最佳條件[23]。利用自制的生物傳感器和空白溶液的標準偏差，得到了4.7 nmol/L 的檢出限，具體構建流程見圖3。

圖2 基于T4 噬菌體的阻抗生物傳感器構建原理Fig.2 Construction principle of impedance biosensor based on T4 phage

圖3 電化學DNA 生物傳感器的制備原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of preparation principle of electrochemical DNA biosensor

如圖3所示，將biao 序列固定在絲網印刷電極表面；再利用生物素化的靶鏈DNA 進行雜交，制備出DNA 傳感器裝置；采用雙電位脈沖伏安法對鏈霉親和素-堿性磷酸酶標記生物素化雜合物產生的阻抗進行電化學檢測。

2.3 電導型生物傳感器在檢測食源性致病菌及其毒素中的應用

電導型電化學生物傳感器通過在金屬電極上施加交流電壓來產生電流，無需參比電極，電極表面通常被涂覆選擇性聚合物和相應的離子載體，選擇性聚合物成膜沉積在金屬電極上，離子載體的濃度和組成的改變會引起的電極間電導發生變化，通過電導參數的變化測定被測物的濃度。電導型傳感器通過改變傳感器組分來優化靈敏度，將電極作為換能器，測量膜的阻抗，阻抗值與膜接觸的樣品溶液中的離子濃度有關[24-25]。由此設計的傳感器，通過阻抗測量，驅動電勢低，具有微型化和大規模生產的優勢。由于原理的相近和技術的共通點，電導型常被看作是阻抗型電化學生物傳感器的一個分支，近年來在醫學領域獲得顯著發展。針對食源性致病菌的檢測，電導型生物傳感器更注重電極表面修飾，降低氧化還原電勢。Liu 等[26]將anti-AFB1抗體固定在金微叉指電極表面，用辣根過氧化物酶封閉剩余的活性位點，測量AFB1濃度，電極表面的抗原-抗體結合物影響了HRP 對底液的催化反應，電解質電導的變化與AFB1濃度成反比。Solcktkin等[27]釆用差分模式，制備出一種基于金叉指薄膜電極和AChE 活性抑制的傳感器，催化底物水解，溶液電導隨電極薄膜上離子濃度的變化而變化。利用此體系檢測黃曲霉毒素B1，檢出限達到0.05 μg/mL。

2.4 電勢型生物傳感器在檢測食源性致病菌及其毒素中的應用

電勢型電化學傳感器通過檢測工作電極和參比電極之間電流為零時的電勢變化與電化學反應中離子活性的關系來測量分析物的濃度，基于生物電識別分析，結合多電極接口陣列，可實現高通量檢測。在實際應用中，通常與免疫分析方法相結合[28]。Rameil 等[29]開發了一種電位黃曲霉毒素M1免疫傳感器，該測定系統由多克隆anti-AFM1抗體，Ag/AgCl 參比電極和HRP-AFB1綴合物組成工作電極。利用3-（4-羥基苯基）-丙酸（p-hydroxybenzene propanoic acid，p-HPPA）作為辣根過氧化物酶的電子給體化合物（HRP），為標記HRP 的抗原提供電子，測試底液中含有的H2O2，電勢的變化隨AFM1濃度增大而減小。基于該方法檢測黃曲霉毒素M1，獲得了良好的線性關系和檢出限，其中檢出限達到500 pg/mL。Larou 等[30]開發了一種基于生物電識別法（bioelectric recognition assay，BERA）的快速檢測黃曲霉毒素M1的生物傳感器系統。通過將AFM1同源抗體電植入非洲綠猴腎細胞的細胞膜上來實現，銀絲工作電極和參考電極插入待測液中，AFM1與細胞膜中的抗體相互作用后使細胞膜電勢發生改變。在極低濃度5 pg/mL 下，可以實現在3 min 內的快速檢測。該檢測系統使用多細胞電極接口陣列，允許高通量的AFM1分析，每小時可完成160 次獨立測試。

3 結論與展望

電化學生物傳感器的電極系統組成、電極類型和電解液構成都關乎其靈敏度與特異性，在現有研究基礎上構建新型復合生物傳感器平臺，拓寬電極修飾材料種類，是推動其廣泛應用的發展方向，而細致應用分類也是需要完善的問題。電流型傳感器發展最為成熟，但需要提高選擇性和靈敏度，減少預處理過程，才能實現商業化。阻抗型電化學生物傳感器雖然能比其他常規的電化學方法得到更多的電極界面結構的信息，但在檢測低濃度微生物時成本較高，限制了其在實際中的應用。電導型和電勢型傳感器由于原理與其他兩種較為相近，實際應用中不是很廣泛。為了提高傳感器的靈敏度和特異性，可以改善電極表面微結構，使用復合材料和納米材料。為了實現超靈敏和高通量，就要完善抗體制備技術。另外，為了加快傳感技術的發展，除了要融合生物醫學等新技術，還要設計開發新型傳感器，修飾電極、研發電路模型、研究多樣轉導機制，解決傳感器壽命、不可重復、穩定性差等問題，實現智能化、便攜化、商業化發展。在食品加工制造產業中，食源性致病菌和真菌毒素通常以非常低的濃度存在，難以檢出，因此電化學傳感器的發展可融合介質電泳、電通透等其他技術多元化發展，探求食源性病原菌及其毒素檢測體系最優化，實現多重目標檢測。電化學傳感技術的發展將為各個領域提供一項快速響應、成本低廉、特異性強、靈敏度高的檢測方法。