橄欖苦苷對核桃油抗氧化穩定性的研究

田 雨 包媛媛 林 奇 楊 明 高聰聰 杜 鵬

(云南農業大學食品科學技術學院，昆明 650201)

核桃油中不飽和脂肪酸含量較高，在人體健康的血壓調節、糖尿病預防等方面都有良好保健作用[1-3]，然而在加工、儲藏、銷售時易存在油脂變質情況，不僅破壞了其內部的營養成分，還危害了身體健康，因此將添加抗氧化劑加入油脂以延緩氧化，延長貨架期是一種最為有效的手段。目前我國常用的抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)等都是化學合成的，存在一定的毒性和副作用，已被一些國家限制或禁止使用[4-5]。對天然抗氧化劑的應用研究以取代化學合成抗氧化劑已成趨勢。橄欖苦苷是一種裂環烯醚萜類多酚化合物，有抗菌[6-7]、抗氧化[8-9]、降血壓[10-11]、抗腫瘤抗病毒[12-14]等功效，且主要存在于橄欖葉中。人們長期以來更關注研究橄欖果和橄欖油的食品實用性，而其葉卻因大量修剪而廢棄，未得到合理利用而造成資源浪費。目前，已有較多有關橄欖苦苷的抗氧化活性研究報道，但鮮見將橄欖苦苷用于核桃油抗氧化的報道。研究對橄欖苦苷進行優化提取工藝，并研究了橄欖苦苷對核桃油的抗氧化效果，以期能為核桃油的抗氧化提供依據，并為木本油料作物的油脂產業升級提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃油：由采購于云南漾濞的核桃壓榨而得；橄欖葉：云南省林業科學院采集而得。

冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、可溶性淀粉、異丙醇、乙醚、氫氧化鈉、酚酞均為分析純；DPPH、TBHQ、VC、檸檬酸；橄欖苦苷：實驗室自制；乙晴(色譜純)。

1.2 儀器與設備

RG-306榨油機；FW-200高速粉碎機；RE-52AA旋轉蒸發器；1200高效液相色譜儀；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱；SK2200B超聲波清洗器；722可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃油的提取

直接由榨油機壓榨核桃仁，再抽濾除雜而得。

1.3.2 核桃油抗氧化穩定性

1.3.2.1 核桃油預處理

依次準確稱取0.015、0.03、0.045、0.06、0.075 g橄欖苦苷樣品，分別加入到裝有150 g核桃油的250 mL碘量瓶中，超聲2 min，使橄欖苦苷與核桃油充分溶解，配成濃度分別為100、200、300、400、500 mg/kg的核桃油樣。分別依次精密稱取0.03 g的TBHQ、VC和檸檬酸加入到裝有150 g核桃油的250 mL碘量瓶中，超聲2 min，使抗氧化劑與核桃油充分溶解，配成濃度都為200 mg/kg的核桃油樣作為對照，同時以不添加橄欖苦苷純樣的核桃油作為空白。將所有核桃油樣置于(60±1) ℃的恒溫干燥箱中，每隔2 d測定核桃油的POV、AV、DPPH、羥自由基和總抗氧化能力，觀察核桃油在10 d內的氧化變質情況。

1.3.2.2 核桃油過氧化值的測定[15]

根據GB 5009.227—2016中的滴定法測定。

1.3.2.3 清除DPPH自由基能力的測定

參看文獻[16]，以乙酸乙酯溶液作為調零參。

式中：Ai為樣品與DPPH反應液于517 nm的吸光度；Ai0為樣品與乙酸乙酯溶液于517 nm的吸光度；A0為DPPH反應液與乙酸乙酯溶液于517 nm的吸光度。

1.3.2.4 清除羥自由基能力的測定[17]

各溶液以及核桃油樣的加入量按表1所示，使反應溶液總體積為15 mL。先在25 mL試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4，6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，再加入適量蒸餾水，最后加0.1%的H2O2溶液，搖勻后置于37 ℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后在3 500 r/min速度下離心10 min，最后吸取上清液于510 nm波長測定吸光度。計算公式：

羥自由基清除率

1.3.2.5 總抗氧化能力的測定

參考文獻[18]，在10 mL試管中分別加入不同濃度的橄欖苦苷核桃油樣品200 mg/kg的TBHQ、VC、檸檬酸核桃油樣，以及不添加橄欖苦苷的核桃油樣，再加入3 mL FRAP工作液混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應10 min，反應結束后于593 nm波長測定吸光度。

1.3.3 響應面試驗設計

由于核桃油中的金屬礦物質元素較豐富，而VC、檸檬酸等有機酸主要是通過與金屬離子絡合，從而形成螯合物，以減弱金屬離子對核桃油過氧化反應的催化，復配后使得核桃油抗氧化的效果得到增加。根據GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，將VC、檸檬酸的添加量設在200 mg/kg最大限制使用量范圍內，再綜合橄欖苦苷單因素實驗結果，選取橄欖苦苷的用量水平。利用響應面法建立模型，以POV值為響應值，采用BOX-Behnken設計響應實驗方案。將核桃油樣于(60±1) ℃的恒溫干燥箱中加速氧化，測定核桃油樣第10天的POV值。表2為實驗因素與水平。

表2 響應面試驗因素與水平

1.3.4 數據處理與分析

每個核桃油樣都測3次平行，得到的數據以平均值±標準差表示，利用Excel 2003處理數據，利用Design-Expert 建立響應面模型，利用SPSS 19.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 橄欖苦苷對核桃油的抗氧化穩定性研究

2.1.1 不同添加量的橄欖苦苷對核桃油抗氧化能力比較

由圖1可以看出，在恒溫干燥箱中放置10 d后，未添加橄欖苦苷抗氧化劑的核桃油POV值高達(69.5±0.65) mmol/kg，而添加了橄欖苦苷抗氧化劑核桃油的POV值明顯都比其小很多，說明橄欖苦苷有良好的抗氧化性，抗氧化效果極顯著(P<0.01)。當橄欖苦苷濃度為200 mg/kg時的抗氧化效果最好，且在橄欖苦苷濃度較低時，對核桃油的抗氧化效果隨著濃度的增加而增強，而后核桃油的抗氧化效果隨著濃度的增加而變弱。

圖1 不同濃度的橄欖苦苷核桃油樣POV-時間曲線

2.1.2 橄欖苦苷與其他抗氧化劑對核桃油抗氧化能力比較

油脂氧化反應的發生有三個階段：第一是引發階段、接著是傳遞階段、最后終止階段[19]。第一階段的氧化反應較緩慢，表現在POV值增幅較小，第二階段的氧化反應速度加快，表現在POV值增幅較大，最后階段油脂基本已經腐敗變質，這時的生成的自由基已經相互結合生成新的穩定化合物。

由圖2可知,空白對照和VC核桃油樣經過4 d的引發期后，進入第二階段，特別是從第6天開始快速增長，到第8天開始進入第三階段終止期；檸檬酸核桃油樣同樣是經過4 d的引發期后，進入第二階段，但是從第6天開始到第10天一直是快速增長期，還沒有進入終止期；跟前面三者相比，橄欖苦苷以及TBHQ核桃油樣的POV曲線變化就很小，一直比較平緩，直到第10天還沒進入第二階段傳遞期。各核桃油樣品前期的POV值的增幅較小，變化較平穩，且在前4 d POV值升高不顯著(P>0.05)。隨著時間的增加，從第6天開始，VC和檸檬酸核桃油樣的POV值開始大幅增加，而橄欖苦苷和TBHQ的核桃油樣在恒溫干燥箱中放置10 d內，POV值一直是緩慢地增長。將這幾種抗氧化劑比較發現：TBHQ、橄欖苦苷VC和有極顯著的抗氧化效果(P<0.01)，檸檬酸有顯著的抗氧化效果(P<0.05)，即抗氧化能力大小為：TBHQ>橄欖苦苷>VC>檸檬酸。

圖2 不同抗氧化劑對核桃油樣抗氧化效果

2.2 橄欖苦苷對核桃油DPPH清除能力研究

2.2.1 不同添加量的橄欖苦苷對核桃油DPPH清除能力比較

DPPH是一種穩定自由基，可以清除樣品中的其他自由基，因此可以通過DPPH的清除能力來說明抗氧化能力的強弱，樣品溶液中紫色消失越多，清除率越大，抗氧化能力越強，最后變為黃色或無色[20]。

1.2 家庭農場在現代農業生產的優勢 家庭農場的內在市場化運作方式和家庭經營的穩定性決定了在市場經濟下有較高的競爭力，在發達國家，以家庭農場為經營方式的已存在近200年，今天依然為農業的最重要經營方式。我國家庭農場是在家庭承包經營基礎上發展起來的，它保留了家庭承包經營的穩定性特點，同時又吸納了現代農業市場化運作方式，其優勢有以下幾點。

觀察圖3發現，隨著時間的增加，不同濃度橄欖苦苷核桃油樣的DPPH清除能力也隨之下降，即核桃油樣氧化的時間越久，其DPPH清除能力就越小。在恒溫干燥箱中放置10 d后，濃度為200 mg/kg的橄欖苦苷核桃油樣的DPPH清除能力明顯優于其他濃度核桃油樣，為(72.5±0.38)%，說明200 mg/kg橄欖苦苷核桃油DPPH清除能力最強，有極顯著的清除DPPH能力(P<0.01)。當橄欖苦苷濃度較低時，核桃油對DPPH的清除能力隨著濃度的增加而增強，當橄欖苦苷濃度大于300 mg/kg時，核桃油的DPPH清除能力隨著濃度的增加而變弱，清除DPPH能力變得不顯著(P>0.05)。

圖3 不同濃度的橄欖苦苷核桃油樣DPPH-時間曲線

2.2.2 橄欖苦苷與其他抗氧化劑對核桃油DPPH清除能力比較

由圖4可知，在恒溫干燥箱放置10 d后，將同為200 mg/kg的抗氧化劑核桃油與空白對照相比：DPPH清除能力下降幅度最多的是檸檬酸核桃油樣，最后僅為(39.6±0.56)%，VC的DPPH清除能力一直保持平穩的下降速度，最后降至(54.5±0.62)%，而橄欖苦苷與TBHQ核桃油樣的DPPH清除能力下降的都比較少且速度較緩慢，橄欖苦苷為(72.5±0.38)%，TBHQ為(87.9±0.45)%,橄欖苦苷與VC的核桃油樣DPPH清除能力差距變得越來越大，說明橄欖苦苷核桃油雖比TBHQ核桃油樣對DPPH自由基的清除能力弱，但對DPPH自由基的清除能力極顯著高于對照檸檬酸、VC和對照(P<0.01)。

圖4 不同抗氧化劑的核桃油樣對DPPH清除能力

2.3 橄欖苦苷對核桃油羥自由基清除能力研究

2.3.1 不同添加量的橄欖苦苷對核桃油羥自由基清除能力比較

觀察圖5可知，隨著時間的增加，不同濃度橄欖苦苷核桃油樣的·OH清除能力也在隨之下降，即核桃油樣氧化的時間越久，其·OH清除能力就越小。在恒溫干燥箱中放置10 d后，濃度為200 mg/kg的橄欖苦苷核桃油樣的·OH清除能力明顯優于其他濃度核桃油樣，為(76±0.62)%，說明200 mg/kg橄欖苦苷核桃油·OH清除能力最強，有極顯著的清除DPPH能力(P<0.01)；還能發現，300 mg/kg的橄欖苦苷核桃油·OH的清除能力為(65.7±0.48)%，有極顯著的清除DPPH能力(P<0.01)，400 mg/kg的橄欖苦苷核桃油·OH的清除能力為(53.9±0.73)%，500 mg/kg的橄欖苦苷核桃油·OH的清除能力卻為(50.6±0.57)%，清除·OH的能力變得不再顯著(P>0.05)，經Duncan和LSD多重比較，發現組間差異極顯著(P<0.01)。

圖5 不同濃度的橄欖苦苷核桃油樣·OH-時間曲線

2.3.2 橄欖苦苷與其他抗氧化劑對核桃油羥自由基清除能力比較

由圖6可知，幾種抗氧化劑都有清除·OH的能力。一開始TBHQ核桃油樣的DPPH清除能力最強，橄欖苦苷與VC的核桃油樣DPPH清除能力相差不多，檸檬酸DPPH清除能力最弱，隨著時間的增加，這幾種抗氧化劑的核桃油樣對DPPH清除能力都在隨之下降，但與空白對照相比DPPH清除能力下降幅度最多的是檸檬酸核桃油樣，最后僅為(39.6±0.6)%，VC的DPPH清除能力一直保持平穩的下降速度，最后降至(51.8±0.7)%，而橄欖苦苷與TBHQ核桃油樣的DPPH清除能力下降的都比較少且速度較緩慢，橄欖苦苷為(75.9±0.62)%，TBHQ為(86.9±0.68)%，橄欖苦苷與VC的核桃油樣DPPH清除能力差距變得越來越大。

圖6 不同抗氧化劑的核桃油樣對·OH清除能力

2.4 橄欖苦苷對核桃油總抗氧化能力研究

2.4.1 不同添加量的橄欖苦苷對核桃油總抗氧化能力比較

觀察圖7可知，100 mg/kg的橄欖苦苷核桃油總抗氧化能力為(54.79±0.36)%,有極顯著的總抗氧化能力(P<0.01)，300 mg/kg的橄欖苦苷核桃油總抗氧化能力為(60.74±0.47)%，有極顯著的總抗氧化能力(P<0.01)，400 mg/kg的橄欖苦苷核桃油總抗氧化能力為(50.57±0.58)%，500 mg/kg的橄欖苦苷核桃油總抗氧化能力為(42.22±0.72)%，當橄欖苦苷濃度為200 mg/kg時核桃油樣的總抗氧化能力明顯優于其他濃度核桃油樣，總抗氧化能力為(69.6±0.55)%，說明200 mg/kg橄欖苦苷核桃油總抗氧化能力最強，總抗氧化能效果極顯著(P<0.01)，經Duncan和LSD多重比較，發現組間差異極顯著(P<0.01)。

圖7 不同濃度的橄欖苦苷核桃油樣總抗氧化能力-時間曲線

2.4.2 橄欖苦苷與其他抗氧化劑對核桃油羥自由基清除能力比較

由圖8可知，這幾個抗氧化劑的總抗氧化能力都在隨著時間增加而變弱，其中TBHQ的總抗氧化能力隨著時間的增加降低的幅度最小，將濃度同為200 mg/kg的不同抗氧化劑核桃油的總抗氧化能力作比較發現：總抗氧化能力測定的最大是TBHQ,僅為(85.9±0.36)%，橄欖苦苷次之，總抗氧化能力為(69.6±0.55)%，VC的總抗氧化能力下降稍快，總抗氧化能力為(54.5±0.68)%,而檸檬酸的總抗氧化能力下降更多,總抗氧化能力為(51.8±0.79)%；將這幾種抗氧化劑與空白對照作比較發現：TBHQ、橄欖苦苷VC和有極顯著的抗氧化效果(P<0.01)，檸檬酸有顯著的抗氧化效果(P<0.05)。

圖8 不同抗氧化劑的核桃油樣總抗氧化能力

2.5 響應面優化實驗結果

2.5.1 響應面實驗設計及回歸模型的建立

用Design-Expert軟件分析表3中的數據，并建立回歸模型，得到二次回歸模型方程Y=4.9-0.77A-0.063B-0.45C+0.11AB-0.14AC+0.45BC+0.73A2+0.71B2+0.36C2。

表3 響應面實驗設計及結果

由表4可以看出，POV模型回歸顯著且失擬項不顯著，R2為0.925 6，說明該方程擬合良好，能解釋92.56%數據的變異性。在因素水平范圍內，各因素對POV值的影響順序為：A>C>B。其中，A項對POV值的影響達到極顯著水平，C項、A的二次項、B的二次項對POV值的影響達到顯著水平，表明各因素對POV值并不是簡單的線性關系。

表4 回歸模型方差分析

注：**極顯著(P<0.01)；*顯著(P<0.05)。

2.5.2 回歸模型的方差分析

由圖9可見，當VC濃度一定時，橄欖苦苷濃度在100～300 mg/kg范圍內，核桃油POV值隨著濃度的增大而先減小后增大，當濃度超過200 mg/kg時隨著橄欖苦苷的濃度增大，變化趨勢較平緩，說明橄欖苦苷濃度超過200 mg/kg后對POV的影響變小；檸檬酸濃度在100～200 mg/kg范圍內，核桃油POV值也隨著濃度的增大而先減小后增大。由等高線可以發現，橄欖苦苷與檸檬酸的交互作用對核桃油POV值影響不顯著。

由圖10可見，當檸檬酸濃度一定時，VC濃度在100～200 mg/kg范圍內，核桃油POV值隨著濃度的增大而增大，欖苦苷濃度在100～300 mg/kg范圍內，核桃油POV值隨著濃度的增大而先減小后增大，當濃度超過200 mg/kg時隨著橄欖苦苷的濃度增大。由等高線可以發現，橄欖苦苷與VC的交互作用對核桃油POV值影響不顯著。

由圖11可見，當橄欖苦苷濃度一定時，檸檬酸濃度在100～200 mg/kg范圍內，核桃油POV值隨著濃度的增大而先減小后增大；VC濃度在100～200 mg/kg范圍內，核桃油POV值隨著濃度的增大而增大，曲線較陡，變化速率較快。由等高線可知，橄欖苦苷與VC的交互作用對核桃油POV值影響不顯著。

圖9 橄欖苦苷與檸檬酸交互作用對POV影響的響應面圖

圖10 橄欖苦苷與VC交互作用對POV影響的響應面圖

圖11 檸檬酸與VC交互作用對POV影響的響應面圖

2.5.3 驗證實驗

通過模型分析，得到優化的最佳復配組合是265 mg/kg橄欖苦苷+135 mg/kg檸檬酸+197 mg/kg VC ，POV預測值為4.45 mmol/kg。按照最佳復配組合參數進行實驗，得到POV理論值為4.22 mmol/kg，理論值與預測值基本一致，這表明該模型的預測效果良好，響應面模型優化實驗結果可靠。

2.5.4 抗氧化效果比較研究

TBHQ 是目前公認較為理想的油脂抗氧化劑，但隨著人們對健康重視程度的加深，合成添加劑安全性受到質疑，在許多國家的食品加工中只能限制性使用。而本試驗優化的復合抗氧化劑為天然抗氧化劑，無毒副作用，安全性高，且從圖12可以看出,復配組合的抗氧化效果與 TBHQ 相當，因此復配抗氧化劑是核桃油理想的天然抗氧化劑組合。

圖12 復配組合與抗氧化劑對核桃油抗氧化能力比較

3 結論

采用 Schaal 烘箱法以過氧化值為指標，研究橄欖葉提取物橄欖苦苷對核桃油抗氧化作用，以DPPH清除自由基能力為指標，研究橄欖苦苷對核桃油清除DPPH自由基能力的體外抗氧化活性。結果表明，橄欖苦苷對核桃油有抗氧化效果，且在添加量為200 mg/kg時效果最好；橄欖苦苷與其他抗氧化劑相比，對核桃油的抗氧化能力大小：TBHQ>橄欖苦苷>VC>檸檬酸；橄欖苦苷核桃油有較強的清除DPPH自由基能力，且200 mg/kg橄欖苦苷核桃油DPPH自由基清除能力最強，有極顯著的清除DPPH能力(P<0.01)；橄欖苦苷核桃油對DPPH 自由基的清除能力極顯著高于對照檸檬酸、VC和對照(P<0.01)；通過響應面優化試驗，得到最優濃度配方為265 mg/kg橄欖苦苷+135 mg/kg檸檬酸+197 mg/kg VC，與TBHQ對核桃油的抗氧化效果相當，有效延長的核桃油的貨架期。因此可以得到結論：橄欖苦苷是一種有效的油脂天然抗氧化劑。