芝麻抗氧化肽分離純化與結構鑒定的研究

蘆 鑫 李若昀 張麗霞 高錦鴻 孫 強 宋國輝 黃紀念

(河南省農業科學院農副產品加工研究中心1，鄭州 450002)( 河南省農產品生物活性物質工程技術研究中心2，鄭州 450002) (河南農業職業學院3，鄭州 451450) (河南省農科院農副產品加工研究所4，鄭州 450002)

芝麻是世界重要油料作物之一，2014年全球芝麻產量623萬t。我國是芝麻生產與消費大國，年均消費芝麻在100萬t以上[1]。我國芝麻主要用于榨油，榨油后的副產品芝麻餅粕的蛋白質含量能達到50%左右，研究表明，芝麻蛋白是一種營養價值較高的蛋白質資源，但受加工技術所限，通常作飼料或肥料，使芝麻蛋白質資源未得到充分利用[2-4]。將蛋白通過酶解轉化為具有功能性肽類是深加工的常用方式，研究表明，芝麻蛋白通過酶解可以產生抗氧化肽[5-7]。

目前，前人對芝麻抗氧化肽的研究主要集中在制備與活性檢測，對芝麻抗氧化肽的結構鑒定、結構組成研究較少[8]。多肽結構與抗氧化活性有密切關系，多肽的結構鑒定是揭示構效關系的基礎，也是指導后續生產應用的基礎[9-10]。本研究采用胰蛋白酶水解芝麻蛋白制備抗氧化肽，酶解液采用納濾脫鹽、超濾初步分離純化，然后采用制備液相進行純化，隨后采用高效液相質譜聯用儀獲取多肽序列，合成上述多肽，驗證抗氧化活性，為芝麻蛋白的資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻蛋白：實驗室自制，制備方法參照袁東振[11]，芝麻蛋白溶液采用截留分子質量為5 000 u透析膜透析，凍干，獲得芝麻蛋白，芝麻蛋白濃度為(92.17±0.31)%。

多肽VALVTGGDSGIGR、DVANEANQLDLK、ELFFGAGGENPESFFK、QDNANNA- NQLDPNPR、ENIEHTAATHSYNPR：上海吉爾生物公司合成；胰蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)、2, 2′-聯氮雙( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS)、2, 4, 6-三硝基苯磺酸( TBNS)、2, 4, 6-三吡啶基三嗪(TPTZ)： 美國sigma-aldrich公司；平膜RO4、NFM、UE003、UE005、UE008、UE010：中科瑞陽膜技術有限公司；甲醇：色譜純，德國MERCK集團；其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司。

LC-500型制備液相；Testcell C-70 平膜裝置；TGL20M-Ⅱ高速冷凍離心機；UV-6300雙光束型紫外可見分光光度計；DNM-9606酶標分析儀等設備用于實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 芝麻多肽的制備

取一定質量芝麻蛋白加入0.06 mol/L pH8.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，配成質量濃度5%的蛋白溶液，加酶量8 000 u/g蛋白加入胰蛋白酶，45 ℃反應2 h，沸水浴10 min終止反應，冷卻室溫。在此酶解條件下，酶解液的水解度為(17.54±0.17)%。采用3 mol/L HCL調節pH到7，10 000 r/min離心30 min，收集上清液(SPT)備用。

1.2.2 納濾脫鹽

將SPT裝入平膜裝置，采用NFM納濾膜脫鹽，操作壓力為5 MPa，攪拌速度400 r/min，透過液達到料液體積80%時，終止納濾，截留液補充蒸餾水到初始酶解液體積，進行第二次納濾，納濾過程重復三次，截留液(SPTN)備用，測定脫鹽率與多肽回收率。

式中：Rs為脫鹽率；mrs和mfs為50 mL截留液和初始酶解液中灰分質量/mg。

式中:Rp為多肽回收率；Crp和Cfp為截留液和初始酶解液中多肽濃度/mg/mL；Vr和Vf為截留液和原始酶解液體積/mL。

1.2.3 超濾分離酶解液

SPTN依次通過UE010(截留分子質量10 ku)、UE008(截留分子質量8 ku)、UE005(截留分子質量5 ku)、UE003(截留分子質量3 ku)進行超濾，超濾條件為：溫度25 ℃，壓力3 MPa，轉速400 r/min，分成6個組分(<3 ku，3～5 ku，5～8 ku，8～10 ku，>10 ku，脫鹽料液)。測定各組分DPPH、ABTS的IC50和FRAP值。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定

參考TORRES-FUENTES方法稍作修改，取酶解液100 μL加入于96孔酶標板中，隨后加入100 μL 2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液，振蕩30 s，室溫避光反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度Ai，以同樣的方法同時測定100 μL酶解液與100 μL乙醇混合后的吸光度Aj，100 μL DPPH溶液與100 μL乙醇混合后的吸光度Ao[14]。DPPH自由基清除率(DI)計算公式：

調節酶解液濃度至0.01～10 mg/mL，測定DPPH自由基清除率，采用IBM SPSS24的probit回歸計算IC50，即DPPH清除率達到50%時，對應的濃度。

1.2.5 ABTS自由基清除能力測定

調節酶解液濃度至0.01～10 mg/mL，測定ABTS自由基清除率，采用IBM SPSS24的probit回歸計算IC50，即ABTS清除率達到50%時，對應的濃度。

1.2.6 FRAP測定

取50 μL 3 mg/mL 酶解液加入到96孔酶標板中，隨后加入150 μL FRAP工作液(由pH 3.6，0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L TPTZ，20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1比例混合)，振蕩30 s，避光37 ℃反應30 min，在波長591 nm處測定吸光度。另以0～2 mmol/L FeSO4標準溶液作標準曲線[16]。

1.2.7 制備液相分離酶解液

將活性最高的組分，首先通過反滲析膜RO4進行濃縮，濃縮至50 mg/mL，隨后采用0.45 μm針頭濾器過濾，以上樣量4 mL進樣到制備液相。制備液相條件為：色譜柱Ultimate AQ-C18(250×20 mm，5 μm)，55%(V/V)甲醇溶液，其中含0.1%(V/V)三氟乙酸，流速8 mL/min，檢測波長280 nm，1 min/管收集流動相，將各色譜峰對應試管分別混合，測定各個色譜峰的DPPH、ABTS清除能力與FRAP值，確定最強活性的色譜峰。

1.2.8 高效液相質譜聯用儀分析芝麻抗氧化肽序列

將高活性組分采用氮吹儀吹干，寄送到蘇州普泰公司，通過Nano-LC-ESI-MS/MS 分析多肽序列。色譜系統為安捷倫1100 高效液相系統，ESI-MS/MS為美國熱電 LTQ離子阱質譜儀，色譜柱為Thermo Finnigan LTQ Linear Ion Trap。其中高效液相的流動相A由2%(V/V)乙腈水溶液(含0.5%甲酸)，流動相B是90%(V/V)乙腈水溶液(含0.5%甲酸)。測定時，流動相B從初始組成2%在60 min內增加到90%，隨后維持40 min。質譜數據采用ProtTech’s ProtQuest (Norristown, PA, USA)軟件分析。

1.2.9 多肽抗氧化性驗證

合成VALVTGGDSGIGR、DVANEANQLDLK、ELFFGAGGENPESFFK、QDNANN- ANQLDPNPR、ENIEHTAATHSYNPR 5種多肽，將多肽粉分別加入蒸餾水，配成濃度為0.01～5 mg的溶液，測定DPPH和ABTS清除率的IC50,以及FRAP，具體方法見1.2.4，1.2.5，1.2.6。

1.2.10 常規指標測定

芝麻餅粕中蛋白含量測定采用凱氏定氮(GB 5009.5—2016)，轉換系數5.30；多肽濃度測定采用三氯乙酸可溶性氮法[12-13]；水解度測定采用TNBS法[13]；酶解液灰分測定采用550 ℃灰化法(GB 5009.4—2016)。

1.3 數據處理

采用SAS 9.3進行單因素方差分析，0.05水平為顯著，0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 芝麻蛋白酶解液納濾脫鹽

納濾是膜孔徑1～10 nm的壓力驅動膜，分離范圍介于超濾與反滲析之間，對相對分子質量小于200 u的單價離子與有機小分子截留能力差，小分子會透過納濾膜進入透過液，而大分子保留在截留液中[17]。芝麻蛋白酶解液的納濾脫鹽見表1，由表1可知，隨著納濾次數從1次增加到3次，SPT中的鹽分基本除去，為后續芝麻抗氧化肽的分離純化奠定有利基礎。3次納濾后，多肽回收率為(97.76±0.21)%，芝麻多肽基本都保留在截留液中，這表明胰蛋白酶酶解芝麻蛋白主要形成2肽以上的多肽。

表1 芝麻蛋白酶解液的納濾脫鹽/%

注：表中同一列中帶有相同小寫字母的樣品間在0.05水平上無顯著差異，余同。

2.2 芝麻抗氧化肽超濾分離

超濾分離芝麻蛋白酶解液所得組分及抗氧化活性見表2。由表2可知，采用超濾純化SPTN得到的5個組分，抗氧化能力存在顯著差異。低分子組分，如SPTN-I，其抗氧化活性較強，而高分子組分抗氧能力較弱。這與任嬌艷等[18]采用超濾分離草魚蛋白源抗氧化肽，李華等[19]利用超濾分離黑豆抗氧化肽，王章存等[20]超濾分離小麥抗氧化肽的結果相一致。這可能是肽鏈較短，空間位阻作用小，內部的活性基團(巰基、酚羥基)暴露，促進于自由基發生反應[21-22]。

2.3 制備液相純化SPTN-I

芝麻抗氧化肽的制備液相圖譜如圖1所示。由圖1可知，采用制備液相分離SPTN-I時，獲得7個色譜峰，其中P4、P5、P6、P7完全分離，而P1、P2、P3有重疊。制備液相分離SPTN-I的組成及抗氧化活性見表3，P5的抗氧化活性最高，選擇P5進行后續純化。

圖1 芝麻抗氧化肽的制備液相圖譜

組分分子質量范圍/ku組成分例/%DPPH清除能力IC50/mg/mLABTS清除能力IC50/mg/mLFRAP/μmol/mgSPTN-I<337.56±0.216.95±0.07f5.87±0.13f1.97±0.02bSPTN-II3～518.31±0.077.54±0.11e7.09±0.21e2.05±0.03aSPTN-Ⅲ5～812.70±0.1311.62±0.19d9.87±0.16d1.49±0.07cSPTN-Ⅳ8～1010.69±0.1814.85±0.25b11.93±0.09b0.99±0.04eSPTN-Ⅴ>1020.74±0.1517.33±0.06a14.78±0.25a0.75±0.07fSPTN——12.80±0.28c10.61±0.09c1.16±0.05d

表3 制備液相分離SPTN-I的組成及抗氧化活性

2.4 抗氧化肽結構鑒定與活性驗證

通過高效液相質譜聯用分析SPTN-I中P5組分，該峰里有5個多肽(見圖2～圖6)，其二級質譜圖m/z分別為888.77、794.02、665.52、870.69、841.57，采用ProtTech’s ProtQuest軟件分析，其芝麻抗氧化肽的序列見表4。5種多肽的分子質量胰蛋白酶水解生成芝麻抗氧化肽是12肽至16肽之間，相對分子質量在1 328.7～1 774.8 u之間，QDNANNANQLDPNPR的抗氧化能力最強，ELFFGAG GENPESFFK的抗氧化能力較弱。對比其他抗氧化肽，芝麻抗氧化肽與從牛蛙蛋白、金槍魚骨架蛋白的酶解物中得到1 988 u和1 519 u的抗氧化肽相近[23-24]，與從大米蛋白制備的520.77 u抗氧化肽相差較遠[10]。不同來源的抗氧化肽相對分子質量相差懸殊的原因：一是原料蛋白的氨基酸組成存在差異，所形成的多肽組成不同，其實現抗氧化的途徑不同[25]；二是制備抗氧化肽所采用的蛋白酶不同，其形成的多肽大小存在差異。采用胰蛋白酶制備抗氧化肽，由于胰蛋白酶水解位點單一，形成肽段較長，如吳慧等[26]采用胰蛋白酶水解乳清蛋白制備出LDGNAKPTPEGDLEL和LYEDLKPTPEGPMEL抗氧化肽[26]。

圖2 芝麻抗氧化肽ELFFGAGGENPESFFK質譜圖

圖3 芝麻抗氧化肽FESEAGLTEFWDR質譜圖

圖4 芝麻抗氧化肽DVANEANQLDLK質譜圖

圖5 芝麻抗氧化肽ENIEHTAATHSYNPR質譜圖

圖6 芝麻抗氧化肽QDNANNANQLDPNPR質譜圖

觀察芝麻抗氧化肽的氨基酸組成時，發現：5種多肽的C末端都有堿性氨基酸殘基(賴氨酸、精氨酸)，N端以酸性氨基酸殘基或酸性氨基酸的酰胺殘基(除FESEAGLTEFWDR)，推測上述氨基酸因其側鏈有氨基或羧基，具有螯合金屬離子和作為質子供體的作用，從而提高多肽的抗氧化肽能力[27]。文獻

表4 芝麻抗氧化肽的序列、分子量和抗氧化能力

表5 芝麻抗氧化肽的來源蛋白

報道酪氨酸、組氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等對肽的抗氧化性有貢獻[28-30]，除甲硫氨酸和半胱氨酸未在芝麻抗氧化肽中發現，其余氨基酸均存在與抗氧化肽中，其中天冬氨酸殘基5個、苯丙氨酸殘基6個，谷氨酸殘基9個，估計這些氨基酸的存在對芝麻多肽的抗氧化活性起了作用。

采用Protein information resource (PIR)數據庫檢索多肽序列發現(見表5)：芝麻抗氧化肽有4種來源于芝麻11S球蛋白，1種來源于芝麻7S球蛋白。胰蛋白酶水解芝麻11S蛋白，可以從肽段中63～75、167～181、188～199、320～334位點產生抗氧化肽。同時，芝麻11S蛋白也是芝麻蛋白的主體，占芝麻蛋白的60%[31-32]，這預示芝麻11S球蛋白在制備芝麻抗氧化肽過程中起主導作用。因此，高11S蛋白的芝麻品種適宜于芝麻抗氧化肽的制備。

3 結論

采用納濾脫鹽、超濾分離、制備液相純化可以有效分離純化胰蛋白酶酶解芝麻蛋白形成的抗氧化肽，采用Nano-LC-ESI-MS/MS分析5種芝麻抗氧化肽結構。

由納濾與超濾實驗結果可知，胰蛋白酶水解芝麻蛋白形成的多肽，分子量較高，其中<3 ku的組分具有最高的抗氧化活性。

5種芝麻抗氧化肽依次為12肽DVANEANQLDLK、13肽FESEAGLTEFWDR、15肽ENIEHTAATHSYNPR、15肽QDNANNANQLDPNPR、16肽ELFFGAGGENPESFFK，分子質量分別是1 328.7、1 585.7、1 738.8、1 679.8、1 774.8 u。多肽的N端以酸性氨基酸殘基為主，C末端為堿性氨基酸殘基。

芝麻11S蛋白在抗氧化肽的形成過程中起到主導作用，胰蛋白酶水解芝麻11S蛋白可以產生4種抗氧化肽。