復合菌種發酵法提高發芽糙米中γ-氨基丁酸

范媛媛 丁俊胄,2 熊善柏 許綽微 趙思明

(華中農業大學食品科學技術學院1，武漢 430070) (美國伊利諾伊大學香檳分校食品科學與人類營養學系2，厄巴納 61801)

γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid, GABA)作為人體內重要的抑制性神經遞質，在降低心血管疾病[1-2]、高血壓[3]、緩解焦慮[4]，改善神經感知功能、延緩記憶力衰退等方面具有功效[5-7]。

通過谷物種子萌發及對新鮮植物幼芽、葉片進行缺氧處理可生產出高GABA濃度的天然食品。糙米在發芽3 d后GABA含量得到顯著提升，在發芽后期進行缺氧脅迫處理則使含量進一步提高[8-10]。除此以外，化學合成法和微生物發酵法均可制備高純度的GABA。采用微生物制備GABA反應條件易于控制，目前已有用大腸桿菌[11-15]、乳酸菌[13-14]、酵母[15]以及霉菌[16-17]等微生物發酵制備GABA的報道。利用微生物體內代謝的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD; EC 4.1.1.15)為催化酶，以食品級谷氨酸或谷氨酸鈉鹽作為主要底物經谷氨酸脫羧反應制備GABA。

糙米中內源性淀粉酶和蛋白酶在發芽過程被激活，將淀粉和蛋白質等大分子水解[18]，水解產生的小分子糖等營養組分可以被乳酸菌和酵母菌利用[19]。已有研究發現乳酸菌與酵母菌之間存在代謝產物共生與互補效應，酵母菌代謝產物可以刺激乳酸菌活動，為乳酸菌提供營養物質，乳酸菌水解產物則為酵母菌提供豐富的營養來源[20-22]。

本實驗采用發芽糙米為發酵底物，以短乳桿菌、卡斯特酒香酵母為發酵菌種，研究初始pH、接種量、發酵溫度、發酵時間，及菌株配比對GABA發酵產量的影響，優化了復合發酵法強化GABA的工藝條件，并初步探究乳酸菌和酵母菌的共生現象，為利用糙米發芽與發酵制備高濃度GABA食品提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)L2，由中國科學院微生物研究所提供。

卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001，本實驗室從米漿的發酵液分離得到，其保藏號為CCTCC NO: M207150。

稻谷原料為“黃花占”水稻品種：湖北黃岡東坡糧油集團有限公司。

L-谷氨酸、L-亮氨酸葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、檸檬酸二胺、乙酸鈉、殼聚糖。

1.2 儀器與設備

植物氣候培養箱；FE20型實驗室pH計；臺式離心機；722型分光光度計；JMS-50膠體磨。

1.3 方法

1.3.1 發酵液的制備

將活化菌種接種到液體培養基中，培養24-48 h，得到菌種的擴大培養液，按所需體積比加入發酵培養基，得到發酵液。分別取不同發酵時間的發酵液，發酵液經過高速離心機離心，收集清液，向清液中加入0.25 g/L的殼聚糖，攪拌后得絮凝液，將所得的絮凝液過濾，得過濾液，即發酵液粗液。

發酵液粗液中加入1 %(質量比)活性炭，混合均勻后于70 ℃下攪拌30 min，過濾后得到未純化的GABA溶液,將未純化的GABA溶液于25 kPa壓力下濃縮60 min，使濃縮液體積約為濃縮前的1/3，得濃縮的GABA溶液,將濃縮的GABA溶液于90 ℃下滅菌40 min，得高濃度液態GABA。

1.3.2 發芽糙米的制備

選擇實驗用小型壟谷機去掉谷殼制備糙米，參考丁俊胄等[8]報道的發芽條件并采用課題組自行設計改裝的水霧供濕通氣培養裝置[23]制備發芽糙米。

1.3.3 乳酸菌發酵培養基

菌株的活化培養基(即：改良MRS培養基，以g/L計)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，瓊脂15 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉2 g/L，檸檬酸二胺2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，用于菌種的活化。

發酵種子培養基(即GYP種子培養基，以g/L計)：胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，丁二酸鈉5 g/L，用于菌種發酵種子的制備。

發酵培養基(以g/L計)：將發芽糙米加水，使谷物與水的體積比為1∶10，用膠體磨磨漿，在漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，用于發酵合成GABA。

1.3.4 酵母菌發酵培養基

菌株的活化培養基(即YEPD培養基，以g/L計)：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，用于菌株的活化。

發酵種子培養基(以g/L計)：葡萄糖30 g/L，蛋白胨30 g/L，硫酸銨3 g/L，KH2PO41 g/L，用于菌株發酵種子的制備。

發酵培養基(以g/L計)：將發芽糙米加水，使谷物與水的體積比為1∶10，用膠體磨磨漿，在漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，用于發酵合成GABA。

1.3.5 GABA含量的測定

根據Berthelot顯色反應原理，參考姚森等[24]報道的比色法測定GABA含量。

1.3.6 GAD活性的測定

按照1.3.1中描述的菌種發酵的工藝流程，分別取不同發酵時間的發酵液，將發酵液在4 000 r/min下離心10 min，過濾后的上清液即為粗酶液。參考丁俊胄等[8]報道的方法測定GAD活性。

取0.3 mL粗酶液與0.2 mL底物反應液(含50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 5.7)、0.2 mmol/L 磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)，100 mmol/LL-谷氨酸)置于10 mL比色管中，于30 ℃水浴鍋里保溫2 h后迅速冰浴終止反應，同時取0.3 mL蒸餾水與0.2 mL底物反應液做空白對照，采用1.3.5中比色法測定GABA的含量。

酶活計算方法為：(酶反應生成的GABA含量-空白中GABA含量)/反應時間。

以每分鐘生成1 μmol GABA所需要的酶量為一個谷氨酸脫羧酶活力單位(U)。

1.3.7 適宜培養基初始pH的確定

設定培養基初始pH，按體積比4%的接種量接入種子液，乳酸菌在30 ℃下發酵培養60 h(酵母菌發酵培養96 h)，測定不同pH下發酵液中GABA的含量。

1.3.8 適宜接種量的確定

乳酸菌設定培養基初始pH 4.5(酵母菌設定培養基初始pH 5.5)，分別按不同體積比接入種子液，于30 ℃溫度下發酵培養60 h(酵母菌發芽培養96 h)，測定不同接種量下發酵液中GABA的含量。

1.3.9 適宜發酵溫度的確定

乳酸菌設定培養基初始pH 4.5(酵母菌設定培養基初始pH 5.5)，按體積比4 %的接種量接入種子液，分別在不同發酵溫度下發酵培養60 h(酵母菌發酵培養96 h)，測定不同發酵溫度下發酵液中GABA的含量。

1.3.10 適宜發酵時間的確定

乳酸菌設定培養基初始pH 4.5(酵母菌設定培養基初始pH 5.5)，按體積比4%接種量接入種子液，于30 ℃下發酵培養，測定不同發酵時間下發酵液中GABA的含量。

1.3.11 發酵法條件的正交實驗設計

根據單因素實驗結果，選取接種量、發酵培養時間和培養溫度3個因素，每個因素確定3個水平，不考慮交互作用，選用L9(34)進行正交實驗，見表2。

1.3.12 復合菌種對發酵的影響

將發芽糙米加水(發芽糙米∶水=1∶10，V/V)磨漿，向漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，按體積比為4%的接種量向漿液中接種復合菌種(乳酸菌和酵母菌)，乳酸菌∶酵母菌(數量比)=1∶1時，攪拌混勻后于30 ℃下密封發酵90 h，得含GABA的發酵液。在用復合菌種發酵富集GABA過程中設計了不同的菌種和配比，以探索復合菌種對發酵液GABA含量的影響。按待發酵漿液體積為1 L，實驗設計見表1。

表1 菌種配方設計

1.3.13 數據處理

各組實驗重復3次，用SAS 8.1統計軟件(SAS Software Institute, Cary, NC,USA)進行統計分析，顯著性差異檢測限設定為P=0.05。

2 結果與分析

2.1 發酵過程GABA的累計

不同培養條件下，發酵過程GABA的積累曲線見圖1。由圖1a可知，乳酸菌在培養基初始pH為4.5時，發酵液中GABA的含量達到最大值。而酵母菌在培養基初始pH 5.5時，菌種發酵制備的發酵液中GABA的含量達到最大值。由于GAD蛋白分子上含有許多酸性或堿性的側鏈基團，較高或較低的pH都可能影響GAD蛋白分子的構象，使側鏈基團電解，降低GAD的活性，從而對GAD與L-Glu結合的能力產生影響[25]，使GABA累計量降低。接種量對乳酸菌和酵母菌產GABA的影響結果見圖1b。隨著接種量的增加，微生物代謝產生的GAD活性增強，GABA累積量逐漸增加。當乳酸菌和酵母菌接種量均大于4%時，隨著底物的減少，接種量增大并沒有顯著增加發酵液中GABA的含量。發酵培養溫度對乳酸菌和酵母菌產GABA的影響結果見圖1c。當乳酸菌和酵母菌發酵溫度為30 ℃時，發酵液中GABA的含量最高。

發酵培養時間對乳酸菌和酵母菌產GABA的影響結果見圖1d。隨著培養時間的延長，GABA累積量逐漸增加。乳酸菌發酵法制備 GABA的最適發酵時間為60 h，酵母菌最適發酵時間為96 h。

發酵制備GABA的正交實驗結果及分析見表2、表3。影響乳酸菌發酵液中GABA含量的因素主次為B(培養時間)>C(培養溫度)>A(接種量)，接種量的3個水平對菌種發酵制備的發酵液中GABA的含量有影響(0.05

影響酵母菌發酵液中GABA的含量的因素主次為C(培養溫度)>B(培養時間)>A(接種量)，接種量的3個水平對發酵液中GABA的含量有影響(0.05

圖1 培養條件對GABA積累量的影響

由表2和表3可知，乳酸菌發酵制備GABA的最佳工藝組合為A2BR2C1，即乳酸菌的接種量為4%，于30 ℃溫度下發酵60 h。而酵母菌發酵制備GABA的最佳工藝組合為A2BJ2C1，即接種量為4%，于30 ℃溫度下發酵培養96 h。由于乳酸菌和酵母菌的共生作用，本實驗所制備的發酵液中，GABA的含量高于現有報道中采用酵母菌發酵制備的GABA產品濃度(3～5 g/L)[26]。

表2 正交實驗設計及結果

注：BR代表乳酸菌，BJ代表酵母菌。

表3 正交實驗方差分析表(F/P)

2.2 發酵液乳酸菌和酵母菌的共生效應

乳酸菌和酵母菌復合菌種的配比對菌種發酵產GABA的影響如圖2所示。隨著酵母菌的增加，GABA含量呈現先增加后逐漸降低的趨勢。在復合菌種各配比中又以乳酸菌和酵母菌復合菌種的體積比為2∶1時(乳酸菌液27 mL，酵母菌液13 mL)，發酵液中轉化富集所得的GABA的含量最高，為33.25 g/L，而使用單一菌種乳酸菌或酵母菌發酵制備的發酵液中GABA的含量分別為27.79 g/L和22.04 g/L。由此可見，復合菌種發酵法比單獨使用乳酸菌或酵母菌發酵制備GABA分別提高了19.6%和50.8%。

由圖3可知，乳酸菌發酵48 h時，GAD活性達到了峰值，發酵培養48 h后，GAD活性開始下降(圖3a)。在發酵0～60 h范圍內，GABA的生成量大于消耗量，因此GABA含量不斷地積累，直到60 h達到最高值。隨著底物的不足，GABA生成量和消耗量達到平衡，GABA含量趨于平衡(圖3b)。

酵母菌發酵72 h時，GAD活性達到最大值，此后繼續發酵，GAD的活性隨著發酵時間的延長顯著降低。在發酵時間為24～96 h范圍內，發酵液中GABA的含量隨著發酵時間的延長顯著增加，在發酵時間為96～120 h范圍內，隨著發酵時間的延長，發酵液中GABA的含量并沒有顯著性變化。

乳酸菌和酵母菌共生發酵72 h時，GAD活性達到最大值。在發酵72 h后，GAD活性顯著降低，在發酵時間為24～96 h范圍內，發酵液中GABA含量顯著性增加，但在96～120 h間并沒有顯著變化(圖3b)。乳酸菌和酵母菌之間存在的代謝產物互補效應[21,27]，使得發酵液中產GABA含量比單獨使用乳酸菌或酵母菌高。

圖2 菌種配比對菌體產GABA的影響

注：乳酸菌培養條件：pH 4.5，接種量4 %，溫度30 ℃；酵母菌培養條件：pH 5.5，接種量4%，溫度30 ℃；復合菌種培養條件：復合菌種比例：2∶1，接種量4%,溫度30 ℃。圖3 發酵過程中GABA(a)的累計及GAD(b)酶活性的動態變化

3 結論

發芽糙米經短乳桿菌L2和酵母菌(ZSM001)復合發酵，比單用短乳桿菌和卡斯特酒香酵母發酵分別提高19.6%和50.8%，本研究表明，將乳酸菌和酵母菌復配具有良好的協同共生效應，適宜的發酵工藝為：當短乳桿菌和卡斯特酒香酵母復合菌種的體積比2∶1，接種量4%，于30 ℃溫度下培養90 h，發酵轉化所得GABA的含量最高達33.25 g/L。乳酸菌和酵母菌以適當比例在發酵液中共生時，代謝過程呈現一定互補，微生物體內谷氨酸脫羧酶的活性增強，促進了GABA積累。