一種“裸眼”可視化檢測溶液的pH值及細胞中鐵離子的BODIPY類探針

渠星宇 邊永軍＊, 白 楊 沈 珍

(1晉中學院化學化工學院，晉中 030619)(2南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京 210023)

鐵是人體血液中交換和輸送氧所必需的一種元素，體內大部分鐵以離子形式分布在特殊的血細胞中[1]。人體中鐵離子含量過多或過少都會帶來疾病，甚至死亡。因此，準確及時地檢測生物體內鐵離子的含量非常有意義[2]。目前檢測鐵離子的方法有很多，例如：原子吸收、耦合等離子質譜法、電化學法、熒光分析法[3-6]等。熒光分析法作為一種新型發展起來的檢測方法，具有操作簡單、檢測速度快、無破壞性等優點，已經成為一種十分實用的檢測方法[7-8]。但熒光分析法中有一個急需解決的問題，即：需合成靈敏度高、選擇性好、溶解性好的熒光探針。硼氟二吡咯亞甲基(BODIPY)類熒光染料具有許多優良的光物理性質[9]，例如：摩爾吸光系數高，熒光量子產率高，結構易修飾等，已被廣泛地應用到設計合成Fe3+熒光探針。2005年Bricks等[10]首次報道了一種熒光增強型的Fe3+熒光探針，即在BODIPY熒光染料的中位引入大環，發現該大環可以選擇性地與 Fe3+配合(配位比為 1∶1)。隨后，多種 BODIPY 類探針被合成并被應用到檢測細胞中Fe3+的含量，即通過在BODIPY的母核中位引入羥胺基團[11]、N-吡啶基 N-噻吩基胺基[12]、2-喹啉噻吩基團[13-14]，利用光誘導電子轉移(PET)機理達到熒光強度改變的目的進而檢測細胞中Fe3+的含量。此外，在BODIPY母核的3-，5-位引入對羥基苯乙烯基[15-17]、對磺酸基苯乙烯基[18]、席夫堿類基團[19-21]，通過光誘導分子內電荷轉移(ICT)機理引起探針光譜性質的改變，達到檢測Fe3+。

測定溶液pH值的變化對于許多領域都有非常重要的意義，這些領域包括化學、生物、工業生產等[22]。對于生物分析方面，設計合成pH探針，用于檢測生物細胞的變化、生理反應過程等具有重要的意義[23]。 文獻報道，將(N，N-二甲基)胺基團[24-27]或者苯酚基團[28-29]作為pH值的識別基團，引入到BODIPY母核的中位，利用PET原理達到檢測溶液及生物細胞中pH值的目的。文獻報道把嗎啡啉基團[30-31]引入到 BODIPY 母核的 1-，7-或 3-，5-位或者2-，6-位，利用ICT或PET原理可以實現檢測溶液的pH值。

本論文選用熒光量子產率接近1的BODIPY化合物1作為熒光基團，選用對羥基苯乙烯基團作為功能基團，合理的將功能基團修飾到BODIIPY母核的3-位，得到探針2。盡管文獻曾報道[32]探針2通過化合物1和對羥基苯甲醛反應得到，但是產率較低且沒有研究該化合物的光物理性質。本文選用吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯代替對羥基苯甲醛，與化合物1反應得到探針2，產率為39%。實驗結果表明，探針2基于ICT原理，可以識別弱酸性溶液的pH值，也可以選擇性地檢測生物細胞中的Fe3+含量。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所有的試劑均為分析純，用到的無水CH2Cl2在CaH2中回流并蒸餾得到。無水乙腈采用色譜純。三乙胺采用簡單的蒸餾得到。

氫和碳的核磁共振圖譜均采用布魯克700 MHz核磁儀。高分辨質譜采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL儀器?；|輔助質譜采用ultraflex TOF型儀器。吸收光譜采用TU-1901紫外光譜儀。熒光光譜采用Cary Eclips型熒光光譜儀。細胞成像實驗采用蔡司LSM880共聚焦激光掃描顯微儀。毒性試驗采用ELX808酶標儀。

1.2 合成探針2

探針2的合成路線見Scheme 1?；衔?由文獻報道的BODIPY類熒光染料經典合成方法得到[14]。探針2采用Knoevenagel縮合反應，選用吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯與化合物1反應得到。

Scheme 1 Synthetic route for probe 2:わtriethyl formate and trifluoroacetic acid in CH2Cl2,triethylamine,DDQ,BF3·OEt2,r.t.;ぷ 3-formylphenyl picolinate,AcOH/piperidine,acetonitrile,reflux

探針2的合成方法：在100 mL的兩頸燒瓶中，加入 0.105 6 g(0.44 mmol)化合物 1，0.199 8 g(0.88 mmol)吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯，0.40 mL 無水哌啶，0.40 mL冰醋酸和50.0 mL無水乙腈。在氬氣保護下，使用分水器，加熱至沸，反應過程用薄層色譜(TLC)監測，至化合物1全部消失。反應結束后，冷卻至室溫。反應液分別用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到粗產物。柱層析分離，展開劑用二氯甲烷，得到褐色固體，產率為39%。1H NMR(CDCl3，700 MHz)：7.47(d，J=7 Hz，2H)，7.45(d，J=21 Hz，1H)，7.21(d，J=21 Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.83(d，J=7 Hz，2H)，6.66(s，1H),6.07(s,1H),5.46(s,1H),2.56(s,3H),2.29(s,3H),2.26(s,3H)。13CNMR(CDCl3,175 MHz)：156.77，156.00，154.58，140.85，140.48，136.44,135.00，133.70，129.40，119.03，118.49,116.83,115.87,115.46，14.97，11.58，11.54。 HR-MS(C20H20BF2N2O，[M+H]+)：計算值 353.163 6；實驗值 353.163 0。

1.3 測試熒光量子產率

探針2的熒光量子產率測試條件如下，選用羅丹明6G為標準，溶解到乙醇溶液中(ФF=0.88)，濃度為1μm，激發狹縫和發射狹縫分別為5 nm，激發波長選用546 nm，熒光光譜的積分范圍為550～700 nm。熒光量子產率(Yu)的計算公式為：Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)(Gu2/Gs2)。Ys為羅丹明6G的熒光量子產率，Fu為探針2的熒光光譜積分面積，Fs為羅丹明6G的熒光光譜積分面積，Au為探針2在546 nm處的吸光度，As為羅丹明6G在546 nm處的吸光度，Gu為探針2在不同溶液中的折射率，Gs為羅丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

1.4 識別金屬離子的實驗

將金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+)溶解到蒸餾水中，濃度為 1 mol·L-1。 Fe3+溶解到蒸餾水中，濃度為 0.2 mol·L-1。探針2溶解到甲醇和緩沖溶液的混合溶液中(V/V，1∶2)，濃度為10μmol·L-1。緩沖溶液選用醋酸與醋酸鈉配制的緩沖溶劑，pH為4.00。在滴定實驗中，每次取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后采用微量進樣器不斷加入Fe3+溶液。在選擇性實驗中，取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后加入60μL其他離子。

1.5 細胞成像實驗

HeLa細胞由中國科學院上海生化細胞所提供。HeLa細胞在37℃和5%(V/V)CO2條件下，于DMEM培養基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培養。HeLa細胞貼在六孔板并孵育過夜，之后用PB(pH=6.00)溶液洗3次。探針2溶解到二甲基亞砜(DMSO)溶液中并加入到HeLa細胞中一起孵育并孵育30 min。探針2在培養基中的濃度為5μmol·L-1，多余的探針2用PB(pH=6.00)溶液清洗3遍，用作細胞成像實驗。同時，取用1份相同條件下的HeLa細胞，采用上述方法加入探針2，之后補加100μmol·L-1的FeCl3于培養基中孵育1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作細胞成像實驗。

2 結果與討論

2.1 化合物1和2的光譜特性

化合物1和2在二氯甲烷溶液中的紫外可見吸收光譜圖和熒光光譜圖如圖1所示?；衔?和2均有經典的BODIPY類熒光分子的吸收峰。探針2最大吸收峰位于573 nm，與化合物1相比，紅移了66 nm?；衔?的熒光峰位于581 nm，與化合物1相比，紅移了70 nm。主要原因是探針2在BODIPY母核的3-位引入對羥基苯乙烯基，增大了分子的共軛度。

圖1 化合物1和2在二氯甲烷溶液中的吸收光譜(實線)和熒光光譜(虛線)Fig.1 Absorption(solid line)and fluorescence(dash line)spectra of 1 and 2 in CH2Cl2

探針2在不同溶劑中光譜性質如表1。從數據中可以看出，探針2的最大吸收峰和熒光峰沒有隨著溶劑極性的改變出現明顯的變化規律。探針2在乙腈溶液中的最大吸收峰和發射峰的波長最短，在DMSO溶液中最大吸收峰和發射峰的波長最長。探針2在不同溶劑中的熒光量子產率變化較大，在甲醇溶液中的熒光量子產率最高，為0.90。故而測試探針2對溶液pH值和Fe3+的響應時均采用甲醇與緩沖溶液的混合溶液。

探針2在表1中的各種有機溶劑中的溶解度均良好，但不溶于水。為了選取合適的混合溶劑，測試了探針2在不同比例甲醇和水中的吸收光譜和發射光譜。探針2在純甲醇溶液中最大吸收峰和發射峰依次位于570和585 nm，隨著混合溶液中水的比例加大，最大吸收峰的位置沒有改變，但是強度在下降 (圖2a、b)。當混合溶液中水的比例增大到67%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發射峰的強度變化較??；當水的比例大于67%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發射峰的強度均有明顯的下降。同時，從拍照的圖片中可以明顯看到，無論是日光燈下還是在365 nm紫外燈下，混合溶液中水的比例應該控制在 67%(V/V)及更小(圖 2c、d)。

表1 化合物2在不同溶劑中的光譜數據Table 1 Spectroscopic properties of compound 2 in different solvents at 298 K

圖2 (a)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的吸收光譜圖;(b)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的熒光光譜圖;(c)探針2在不同甲醇與水混合溶液中(0%～86%,V/V)的照片;(d)在365 nm紫外燈下探針2在不同甲醇與水混合溶液中((0%～86%,V/V)的照片Fig.2 (a)Absorption spectra of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents;(b)Fluorescence spectra of probe 2 in different CH3OH-water mixed solvents;(c)Photographs of the probe from CH 3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V);(d)Photographs of probe 2 from CH3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V)under UV lamp of 365 nm

2.2 探針2對弱酸溶液pH值的識別

探針2的吸收光譜和熒光光譜隨溶液pH值的變化曲線見圖3和圖4。探針2在不同pH值溶液中的吸收曲線表明，當溶液的pH≤6.00時，溶液的最大吸收峰位于570 nm并且它的強度在酸性范圍內隨著pH值的減小略有下降；當溶液的pH≥7.00時，溶液的最大吸收峰位于600 nm并且它的強度在中性及堿性范圍內隨著pH值的增大略有下降。同時詳細地測試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內，當不斷加入NaOH溶液調節溶液pH值時，探針2在570 nm處的吸收峰不斷下降，同時在600 nm的吸收峰不斷升高。同時從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00時顯示粉紅色，pH值在6.00～7.00范圍，由粉紅色逐漸變為藍色，pH＞7.00為藍色。實驗結果表明探針2可以作為“裸眼”pH探針。

圖3 (a)在甲醇-水混合溶劑(67%,V/V)中,探針2在最大吸收峰處的吸光度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下,探針2的吸收光譜變化;(c)探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片Fig.3 (a)Effect of pH value on the absorption intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Absorption spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)

圖4 (a)在67%(V/V)的甲醇和水混合溶液中,探針2在585 nm處的熒光強度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下探針2的熒光光譜變化;(c)在365 nm紫外燈下探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片Fig.4 (a)Effect of pH value on the fluorescence intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Fluorescence spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)under UV lamp of 365 nm

探針2的熒光曲線隨溶液pH值的變化表明，當溶液的pH≤6.00時，溶液的最大發射峰位于585 nm并且發射峰的強度在酸性范圍內隨著pH值的減小略有下降；當溶液的pH≥7.00時，溶液的熒光峰消失。同時詳細地測試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內，當不斷加入NaOH溶液調節溶液pH值時，探針2在585 nm處的發射峰波長不變，強度不斷下降。同時從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00顯示紅色的熒光，pH值在6.00～7.00范圍，紅色熒光在不斷消失，pH＞7.00時熒光完全消失。因此，探針2可以作為熒光探針用于測定溶液pH值。此外，利用Henderson-Hasselblad方程對滴定曲線進行擬合(圖4b插圖)，結果表明探針2的p Ka約為6.05。

2.3 探針2對常見金屬離子識別

圖5 加入各種金屬離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖 (a)和熒光光譜圖 (b);在日光燈 (c)和365 nm的紫外燈 (d)下,探針2在不同金屬離子中的照片Fig.5 Absorption(a)and fluorescence(b)spectra of probe 2 upon addition of different metal ions in CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)mixed solution;Photographs of probe 2 upon addition of different metal ions under sunlight(c)and UV lamp of 365 nm(d)

探針2對常見金屬離子(Ca2+,Ni2+,Na+,Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+，Fe3+)的選擇性檢測見圖5。探針2溶解到甲醇和緩沖液(醋酸與醋酸鈉配制的緩沖液，pH=4.00)中，分別加入各種金屬離子，Fe3+的加入量為探針2的400倍，其它金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+)的加入量為探針2的2 000倍，同時測試了該溶液的吸收光譜和熒光光譜圖 (圖5a、b)。吸收光譜圖表明，Fe3+的加入改變了探針2的吸收光譜圖，最大吸收波長由570 nm變化到505 nm，藍移65 nm；Mg2+的加入，使得探針2的吸光度略有下降；其它金屬離子的加入均沒有引起明顯的變化。同時從照片中(圖5c)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液的顏色變為黃色。熒光光譜表明，Fe3+的加入改變了探針2的熒光光譜圖，發射波長由585 nm變化到515 nm，藍移70 nm；Co2+，Cu2+的加入，使得探針2的發射峰的強度略有下降；其它金屬離子的加入均沒有引起明顯的變化。同時從照片中(圖5d)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液在365 nm紫外燈下顯示綠色。實驗結果表明，探針2對Fe3+的檢測具有選擇性，并且能夠在溶液中“裸眼”檢測出Fe3+的存在。

2.4 探針2對溶液中的鐵離子的識別

探針2的吸收和熒光光譜隨著Fe3+加入發生相應變化曲線見圖6。吸收光譜圖及動力學曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的吸收波長發生變化，570 nm處的吸光度在下降，505 nm處的吸光度在上升，當加入400倍的Fe3+時，505 nm處的吸光度為最大。熒光光譜圖及動力學曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的發射波長發生變化，585 nm處的熒光峰在下降，515 nm處的熒光峰在上升，當加入160倍的Fe3+時，515 nm處的熒光強度為最大(圖6d)。探針2與Fe3+的熒光動力學曲線見圖 6e，采用如下公式歸一化：R=1-Ii/Imax，Ii為探針2與Fe3+反應后的熒光強度，Imax為探針2未與Fe3+反應前的熒光強度。熒光反應和Fe3+濃度的擬合曲線得到線性關系為y=0.495 3x-0.017 8，相關系數為0.991 4，可以計算出探針2檢測Fe3+的最低檢出限為0.36 mmol·L-1。實驗結果表明，探針2可以在溶液中檢測Fe3+的存在，并且探針2既是比率計量型的“裸眼”探針，又是比率計量型的熒光探針。

2.5 探針2對弱酸溶液pH值及Fe3+的識別機理研究

探針2與NaOH反應前后的氫核磁譜圖見圖7a。探針2分子結構中的3個-CH3化學位移值分別為2.49、2.32、2.28。 探針2與NaOH反應后-CH3化學位移值為2.43、2.26、2.21。與未加入NaOH比較，化學位移值略有下降。同樣，探針2與NaOH反應后苯乙烯基的化學位移值與探針2比較有較大的下降。參照文獻[29]，可以推測得到探針2在堿性條件下，3-位對羥基苯乙烯基失去羥基H質子，變為氧負離子。探針2與Fe3+反應前后的質譜圖見圖7b。探針2的分子離子峰為352.155，探針2與Fe3+反應后的離子峰為277.123。參照文獻[21]，推測出加入Fe3+后，探針2分子結構中烯烴基團斷裂，氧化為羧酸基。

圖6 加入不同濃度的鐵離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖(a)和熒光光譜圖(c);(b)探針2在570和505 nm處吸光度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(d)探針2在515和585 nm的熒光強度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(e)探針2與Fe3+反應后歸一化的熒光強度隨Fe3+濃度變化的曲線Fig.6 Absorption(a)and fluorescence(c)spectra of probe 2 upon addition of Fe3+in mixed CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)solution;(b)Plot of absorbance vs Fe3+concentration at 505 and 570 nm;(d)Plot of fluorescence intensity vs Fe3+concentration at 515 and 585 nm;(e)Normalized fluorescence intensity of probe 2 after reacting with Fe3+as a function of Fe3+concentration

圖7 (a)探針2在氘帶甲醇中與NaOH反應前后的氫核磁譜圖;(b)探針2與Fe3+反應前后的質譜圖Fig.7 (a)1H NMR spectra of probe 2 in CD3OD before and after the addition of NaOH;(b)MSspectra of probe 2 before and after the addition of Fe3+

2.6 探針2檢測細胞中鐵離子

探針2在活體細胞中對Fe3+的成像見圖8。37℃下，探針2在HeLa細胞中孵育30 min，用530 nm的光激發，可以看到細胞有紅色熒光；用485 nm的光激發，沒有看到熒光(圖 8a、b)。補加 100 μmol·L-1的Fe3+到細胞中，孵育1 h，用530 nm的光激發，沒有看到熒光；用485 nm的光激發，可以看到細胞有綠色熒光(圖8c、d)。同時從明場和交疊場可以進一步證明探針2可以檢測細胞中的鐵離子。細胞質和細胞核染色強度比值較大(I2/I1＞20，圖9)，表明探針2主要染色到細胞質上，細胞核染色較少。實驗結果表明，探針2具有較好的滲透性，可以很好地染色到細胞質，并且能夠高效地檢測細胞中的鐵離子含量。

圖8 探針2在HeLa細胞中共聚焦熒光成像圖片、明場下圖片及交疊圖片:激發波長為530 nm(a)和485 nm(b)下,溫度為37℃時探針2在細胞中孵育30 min的圖片;激發波長為530 nm(c)和485 nm(d)下,溫度為37℃時細胞中補加100μmol·L-1的Fe3+孵育1 h的圖片;細胞在明場下的圖片(e,g);細胞在交疊下的圖片(f,h)Fig.8 Confocal fluorescence,bright field images and overlay images of probe 2 in HeLa cells:Cells incubated with 5 μmol·L-1 bright field of probe 2 for 30 min at 37℃upon excitation at 530 nm(a)and 485 nm(b);Cells supplemented with 100 μmol·L-1 of Fe3+in the growth media for 1 h at 37 ℃ upon excitation at 530 nm(c)and 485 nm(d);Bright field images of cells showed in panel(e,g);Overlay images of cells showed in panel(f,h)

圖9 (a)溫度為37℃時探針2在HeLa細胞中孵育30 min的共聚焦熒光成像圖;(b)分別單個細胞中細胞質 (1)、細胞核 (2)和細胞質 (3)所對應的熒光強度Fig.9 (a)Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with probe 2 for 30 min at 37℃;(b)Fluorescence intensity profile across the line shown in panel A corresponding to cytoplasm(1),nuclear region(2)and cytoplasm(3)

探針2對細胞的毒性實驗見圖10。不同濃度(0～60μmol·L-1)的探針2孵育到細胞中，結果表明，孵育5 h后，20μmol·L-1的探針2細胞存活率達到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細胞存活率降到83%。孵育10 h后，20μmol·L-1的探針2細胞存活率達到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細胞存活率降到78%。上述結果表明，探針2濃度在0～60 μmol·L-1，孵育 10 h，都不會影響細胞的生存，說明探針2可以檢測細胞中的鐵離子含量。

圖10 探針2對細胞毒性試驗Fig.10 MTT of probe 2

3 結 論

通過改進Knoevenagel縮合反應，將對羥基苯乙烯基引入到BODIY的3-位，增加了分子的共軛度，得到了熒光探針2。探針2易溶于常見的有機溶劑，具有大的摩爾吸光系數和高熒光量子產率(＞0.60)。探針2在甲醇-水的混合溶劑中隨溶液pH值的增大發生波長紅移和熒光淬滅，可以作為“裸眼”探針檢測弱酸溶液的pH值。并且對溶液及活體細胞中的Fe3+表現出吸收和熒光光譜的比率計量型變化，且細胞毒性低，可以應用在生物體系中Fe3+的檢測。