Tim-3/Galectin-9在原發性肝癌中的表達變化及臨床意義探討

蘭勇 陳明 邢人偉

[摘要] 目的 探討T細胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）在原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）中的表達變化及臨床意義。 方法 回顧性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除術的PLC患者的臨床資料。檢測并對比肝癌組織及癌旁組織中Tim-3、Galectin-9表達情況，統計Tim-3、Galectin-9不同表達情況時患者病理參數、隨訪1年內復發和死亡情況。 結果 肝癌組織中Tim-3陽性表達率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽性表達率顯著低于癌旁組織（P<0.05）;Tim-3、Galectin-9陽性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、病理分型、TNM分期患者構成比比較差異不顯著（P>0.05），Tim-3陽性組腫瘤直徑≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、無腫瘤包膜患者構成比顯著高于陰性組（P<0.05），Galectin-9陽性組腫瘤直徑≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、無腫瘤包膜患者構成比顯著低于陰性組（P<0.05）;術后1年內復發和死亡患者中Tim-3陽性表達率顯著高于未復發和存活患者（P<0.05）;復發和死亡患者中Galectin-9表達率顯著低于未復發和存活患者（P<0.05）。 結論 Tim-3的高表達、Galectin-9低表達與PLC多種病理學特征有關，且復發與未復發、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達存在差異，可能成為臨床中評估PLC患者預后的重要指標之一。

[關鍵詞] T細胞免疫球蛋白粘蛋白-3;半乳糖凝集素-9;原發性肝癌;復發;死亡

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）04-0049-05

[Abstract] Objective To investigate the expression changes and clinical significance of T cell immunoglobulin mucin-3（Tim-3）/Galectin-9 in primary liver cancer（PLC）. Methods The clinical data of 110 PLC patients who underwent radical resection from June 2014 to June 2016 were retrospectively analyzed. The expressions of Tim-3 and Galectin-9 in liver cancer tissues and adjacent tissues were detected and compared. The pathological parameters， the recurrence and death within 1 year of follow-up of patients with different expressions of Tim-3 and Galectin-9 were analyzed. Results The positive expression rate of Tim-3 in liver cancer tissue was significantly higher than that in adjacent tissues（P<0.05）. The positive expression rate of Galectin-9 in liver cancer tissue was significantly lower than that in adjacent tissue（P<0.05）. There was no significant difference in gender， age， liver cirrhosis， serum alpha-fetoprotein（AFP）， hepatitis B surface antigen（HBsAg）， pathological type， and the composition ratios of TNM staging in Tim-3 and Galectin- 9 positive and negative groups（P>0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， no tumor capsules in Tim-3 positive group was significantly higher than that in the negative group（P<0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， and tumor-free capsule was significantly lower than that of the negative group（P<0.05）. The positive rate of Tim-3 expression in patients with recurrence and death within 1 year after surgery was significantly higher than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. The expression rate of Galectin-9 was significantly lower in patients with relapse and death than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. Conclusion The high expression of Tim-3 and the low expression of Galectin-9 are related to various pathological features of PLC， and there are differences in the expression of Tim-3 and Galectin-9 in patients with recurrence and non-recurrence， and in death and survival patients. They may become one of the important indicators for evaluating the prognosis of PLC patients.

[Key words] T cell immunoglobulin mucin-3; Galectin-9; Primary liver cancer; Recurrence; Death

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均較高[1]。由于早期無癥狀或癥狀不明顯，確診時多數患者已至局部晚期或遠端轉移，治療難度增加且預后差，術后1年復發率超過30%，而術后5年生存率不足10%，給人們的健康和生命造成嚴重威脅[2]。隨著分子生物學研究逐漸深入，人們發現機體免疫系統失衡在腫瘤進展過程中起重要作用。T細胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）是一種優勢表達于Ⅰ型輔助性T淋巴細胞（type Ⅰ helper T lymphocyte，Th1）表面的特異性表面標志物，通過Tim-3/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）信號通路調節Th1/Th2免疫平衡，進而參與腫瘤進展[3-4]。但Tim-3、Galectin-9在PLC中的表達及其對預后的影響鮮有報道。鑒于此，本研究回顧性分析我院收治的PLC患者的臨床資料，通過分析Tim-3、Galectin-9在癌組織及癌旁組織中的表達情況，并分析其與臨床病理特征及預后的關系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除術的PLC患者的臨床資料，其中男72例，女38例，年齡38～72歲，平均（51.35±6.80）歲，肝硬化91例，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性98例，腫瘤直徑<5 cm者73例、≥5 cm者37例，病理分型[5]：肝細胞癌99例、膽管細胞癌9例、混合癌2例，美國癌癥聯合委員會TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期者82例、Ⅲ～Ⅳ期者28例，單發病灶76例、多發病灶34例。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準? （1）病理學確診為PLC;（2）行根治性切除術，術后組合考慮接受輔助放化療;（3）隨訪時間≥1年者;（4）臨床資料完整者。

1.2.2 排除標準? （1）合并其他原發性腫瘤者;（2）嚴重貧血、感染或合并嚴重凝血功能障礙及心血管疾病者;（3）妊娠期或哺乳期婦女。

1.3 方法

1.3.1 資料收集? 統計患者就診時間、性別、年齡、術前血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、HBsAg、病理類型及TNM分期、腫瘤直徑、病灶是否單發、是否肝硬化、腫瘤是否有包膜覆蓋、是否發生血管侵犯等基本資料。統計患者術后1年內復發或死亡情況。復發診斷：經穿刺活檢證實術后復發情況。

1.3.2 Tim-3、Galectin-9陽性表達檢測? 應用免疫組織化學法檢測肝癌組織及癌旁組織中Tim-3、Galectin-9表達情況。A切片：取肝癌組織及癌旁組織常規制作石蠟切片，切片機制作4 μm連續切片;B脫蠟及水化：切片經二甲苯脫蠟后，依次放入二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅲ 5 min，并利用不同濃度梯度酒精（100%→95%→85%→70%→50%）水化;C抗原熱修復：將預處理的檸檬酸鹽抗原修復液放置于壓力鍋中，加熱至沸騰后將切片放入壓力鍋中，當壓力閥噴氣后繼續加熱2 min停止加熱，自然冷卻，取出切片用自來水沖洗，并將其浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液中;D染色前處理：用免疫組化專用筆在組織周圍畫圈標注，再用PBS洗滌3次，每次5 min，玻片自然晾干，加入3%的過氧化氫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min;E滴加抗原：每張切片分別加入50 μL一抗（鼠抗人Tim-3、Galectin-9單抗，Thermo公司），盡可能覆蓋組織，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次每次5 min，然后加入二抗（山羊抗鼠Tim-3、Galectin-9 免疫球蛋白G，Thermo公司），室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min;F顯色：辣根過氧化物酶顯色試劑盒（R&D公司）顯色，光鏡下觀察控制反應時間，顯色滿意后自來水沖洗，中性樹膠封片;G光鏡下觀察：在200倍光鏡下隨機選取5個不重復的視野，以細胞呈現黃色或棕黃色判定為陽性細胞，計算陽性細胞率，并進行蛋白表達程度判定[7]：陽性細胞率<10%記為陰性，陽性細胞率≥10%記為陽性。

1.4觀察指標

①對比Tim-3、Galectin-9不同部位表達率;②Tim-3、Galectin-9表達與病理參數的關系;③復發與未復發患者Tim-3、Galectin-9表達差異;④死亡與存活患者Tim-3、Galectin-9表達差異。

1.5統計學分析

采用SPSS17.0統計學軟件對數據分析處理，計數資料以[n（%）]表示，理論頻數≥0且≤5時組間計數資料進行校正檢驗，理論頻數>5組間計數資料進行χ2檢驗;采用秩和檢驗分析等級計數資料。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tim-3、Galectin-9不同部位表達率比較

肝癌組織中Tim-3陽性表達率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽性表達率顯著低于癌旁組織（P<0.05）。見表1、封三圖8。

2.2 Tim-3、Galectin-9表達與病理參數的關系

Tim-3陽性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HBsAg、病理分型、TNM分期患者構成比比較，差異均無統計學意義（P>0.05），Tim-3陽性組腫瘤直徑≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、無腫瘤包膜患者構成比顯著高于陰性組（P<0.05）;Galectin-9陽性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HBsAg、TNM分期、病理分型患者構成比比較，差異均無統計學意義（P>0.05），Galectin-9陽性組腫瘤直徑≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、無腫瘤包膜患者構成比顯著低于陰性組（P<0.05）。見表2。

2.3復發與未復發患者Tim-3、Galectin-9表達差異

術后1年內復發患者中Tim-3陽性表達率明顯高于未復發患者，差異有統計學意義（P<0.05）;復發患者中Galectin-9表達率明顯低于未復發患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 死亡與存活患者Tim-3、Galectin-9表達差異

術后1年內死亡患者中Tim-3陽性表達率明顯高于存活患者，差異有統計學意義（P<0.05）;死亡患者中Galectin-9表達率明顯低于存活患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3討論

PLC是一種高發惡性腫瘤，主要包括肝細胞癌、肝內膽管細胞癌及混合性癌等多種病理類型，肝炎病毒感染、家族疾病史、嗜酒及黃曲霉毒素長期暴露等均是導致PLC發病的危險因素[8-9]。隨著醫療技術的飛速發展，癌癥的治療取得了較大進步，但PLC患者的預后仍然較差，中位生存期不足1.5年[10]。因此，亟需尋找早期預測復發和轉移的標志物，以及時制定并實施有效治療措施，對改善PLC患者預后、延長生存期有重要意義。

本研究發現，肝癌組織中Tim-3陽性表達率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽性表達率顯著低于癌旁組織（P<0.05），提示肝癌組織中Tim-3異常高表達、Galectin-9異常低表達。Tim-3是一種優勢表達于CD4+、CD8+細胞表面的一種抑制性分子，可調節Th1細胞免疫功能，且抑制干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的生成[11]。高表達的Tim-3可影響腫瘤微環境中的IFN-γ生成及Th1細胞功能，下調免疫系統功能，利于肝癌細胞的免疫逃避[12]。Galectin-9是β-半乳糖苷結合蛋白家族重要成員之一，在T細胞及胸腺細胞的發育、腫瘤細胞的分化、轉移方面發揮重要作用[13]。Galectin-9是Tim-3的特異性配體，二者結合可介導T細胞免疫耐受[14]。既往研究發現[15-16]，多種腫瘤組織如黑色素瘤、乳腺癌組織中，Galectin-9呈陰性表達，而在正常組織中高表達，與本研究結果一致。由此，PLC患者癌組織中Tim-3異常高表達與Galectin-9的異常低表達，利于肝癌細胞增殖。

此外，本研究中，Tim-3陽性組腫瘤直徑≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、無腫瘤包膜患者構成比顯著高于陰性組（P<0.05），Galectin-9陽性組上述指標顯著低于陰性組（P<0.05）;術后1年內復發和死亡患者中Tim-3陽性表達率顯著高于未復發和存活患者（P<0.05）;復發和死亡患者中Galectin-9表達率顯著低于未復發和存活患者（P<0.05），提示Tim-3、Galectin-9與PLC多種病理學特征有關，且復發與未復發、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達存在差異。癌組織中浸潤的大部分CD8+ T淋巴細胞表面Tim-3大量表達，但該表型中的T細胞增殖及分泌炎癥細胞因子的功能基本喪失，且與腫瘤惡性程度密切相關[17]。Tim-3參與腫瘤浸潤及轉移與血管形成、腫瘤微環境缺氧、免疫逃逸等多種調節機制，可能是導致不同臨床表現患者Tim-3表達差異的原因[18]。既往研究證實，多種腫瘤組織中Galectin-9呈強陽性表達，并與患者預后有關，如在乳腺癌組織中，伴遠端轉移的Galectin-9陽性患者無復發生存率為95%，顯著高于陰性表達者的44%，有淋巴結轉移的陽性患者生存率達90%，顯著高于陰性表達者的25%[19-20]。癌組織中Galectin-9高表達者有效抑制腫瘤進展，可能是高表達Galectin-9與高表達Tim-3的Th1細胞結合，重新調節Th1/Th2平衡狀態，利于腫瘤微環境的免疫監視作用，改善PLC患者的預后[21]。因此，Tim-3、Galectin-9表達情況與PLC患者的多種病理特征有關，并且可影響患者預后。

綜上所述，Tim-3的高表達、Galectin-9低表達與PLC多種病理學特征有關，且復發與未復發、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達存在差異，提示臨床中可通過檢測此二種蛋白在肝癌組織中的表達評估預后，并可通過積極控制Tim-3、Galectin-9的表達，干擾PLC進展，進而改善預后。

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（收稿日期：2018-07-13）