臭氧脅迫對大豆氮磷化學計量特征的影響

武紅艷，王巖，趙天宏，田榮榮，張銘，孫銘禹

沈陽農業大學農學院，遼寧 沈陽 110866

對流層臭氧（O3）是一種主要由氮氧化物和揮發性有機物經過光化學反應生成的二次污染物（Bytnerowicz et al.，2008）。在中國，隨著工業化和城市化的快速發展，臭氧前體污染物（氮氧化物和揮發性有機物）排放量增加，導致 O3濃度快速增加（Feng et al.，2015）。沈陽是東北重工業城市，其夏季平均O3濃度已達到60 nmol·mol-1以上，超過敏感植物的臭氧損傷閾值 40 nmol·mol-1（王闖等，2015）。臭氧濃度升高會對植物生長發育和營養吸收產生一定的影響，例如葉片損傷，葉綠素含量降低，光合速率下降，加速其衰老（平琴等，2017），影響植物根系發育和土壤過程（Nikolova et al.，2009），從而間接影響植物對營養物質（如氮和磷）的吸收和分配（Zheng et al.，2013）。

生態化學計量學（Ecological Stoichiometry）是研究有機體內化學元素平衡和生態系統能量平衡的學科（Austin et al.，2012），主要是強調有機體內碳（C），氮（N）和磷（P）等元素間的化學計量關系（Allen et al.，2009）。氮、磷作為植物體內的主要營養元素，與植物結構及功能有密切聯系，其化學計量特征能夠反映植物的生長速率、養分利用效率及限制性元素（Song et al.，2014）。近年來國內外已經進行了N和P生態化學計量的研究，但主要集中在干旱、CO2濃度升高、氮沉降及施肥對植物等方面的研究。孫彩麗等（2017）研究表明，氮素添加顯著提高白羊草（Bothriochloa ischaemum）地上部分N/P，干旱脅迫對白羊草地上部分N/P無顯著影響。Yuan et al.（2015）的研究表明，CO2濃度增加會使植物的 N/P普遍降低。但是涉及到 O3脅迫對植物氮磷化學計量特征的研究較少，且結果較不一致。賈一磊（2017）研究表明，臭氧濃度升高使4種小麥（Triticum aestivum L.）成熟期葉片N、P濃度均增加，但不同品種間增加程度有差異；Shang et al.（2018）研究發現，臭氧濃度升高對兩種克隆楊樹（Populus L.）的生態化學計量特征有顯著影響，其中N、P濃度顯著升高，而N/P沒有影響，同時對兩種克隆楊樹的P吸收無影響，說明楊樹生長受N素限制，土壤中的有效磷足以維持其生長。因此，在全球氣候變化的背景下，研究臭氧濃度升高情況對植物生態化學計量特征的影響，對預測未來生態過程和生物地球化學循環有重要作用。

大豆（Glycine max）是東北區的主產作物之一，也是對O3污染最為敏感的作物之一（Morgan et al.，2004）。本研究以“鐵豐29號”大豆為試驗材料，采用開頂式氣室法（OTCs），分析O3濃度升高對大豆根、莖、葉N、P化學計量特征及養分限制情況，有助于了解臭氧濃度升高條件下大豆N、P分配格局及養分限制狀況，為提高大豆生產力和農業可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗以大豆栽培品種“鐵豐 29號”為試驗材料，該品種的生育期為130－133 d，適合在中等或中等以上肥力的土壤中種植。本研究利用開頂室氣室（OTCs）對大豆進行熏蒸試驗，主要設備包括OTCs（橫截面為正八邊形，邊長1.15 m，高2.4 m，玻璃室壁）、臭氧發生器（BGY-Q8，北理國科，中國）、臭氧傳感器（S-900，Aeroqual Ltd.，新西蘭）、溫濕度傳感器以及數據分析與自動控制充氣系統。在整個試驗期間，控制氣室內實際氣體濃度穩定。

1.2 試驗地點

試驗在中國科學院沈陽農田生態系統國家野外科學觀測研究站進行。研究站位于沈陽市蘇家屯區十里河鎮（41°31′N，123°24′E），年平均氣溫為 7－8 ℃，大于 10 ℃的年平均積溫為 3100－3400 ℃，年均降雨量為700 mm，無霜期為147－164 d，主要土壤類型為草甸棕壤。土壤（0－20 cm）全 N 1.18 g·kg-1，全 P 0.51 g·kg-1，全 K 23.17 g·kg-1，有機質 12.03 g·kg-1。

1.3 試驗設計

試驗在中國科學院沈陽野外農田生態系統生態站進行，室內試驗在沈陽農業大學生態學實驗室進行。試驗設3個處理：CK處理（對照，環境濃度），T1 處理[O3濃度為(80±10) nmol·mol-1]和 T2處理[O3濃度為(110±10) nmol·mol-1]。采用盆栽試驗，PVC桶高30 cm，直徑34 cm，每個氣室20桶。2017年5月10日播種于氣室內，每個氣室大約120株（相當于18萬株/hm2），大豆出苗20 d后開始進行熏蒸試驗，每天熏蒸8 h（9:00－17:00）。試驗期間水分、肥料均勻一致，無病蟲害及雜草等限制因素。分別于大豆分枝期（6月 26日）、開花期（7月18日）和結莢期（8月10日）取樣，8月30日停止通氣直至成熟。在每個生育時期每個處理分別隨機采集植株樣品3株，連同地下莖、根系一同挖出，用保鮮膜將其包好防止失水，帶回實驗室測定，每個氣室內重復3次。

1.4 測定指標及方法

每次采集完大豆植株樣品，立即沖洗干凈，用吸水紙吸干植株表面多余水分，按照根、莖、葉片剪開，然后分別將植株樣品剪碎，放入烘箱，于105 ℃下殺青30 min，然后于80 ℃下烘干至恒重；將植株樣品磨碎并過0.25 mm篩，使用濃H2SO4碳化，H2O2高溫消煮，采用凱氏定氮法測定全氮含量，鉬銻抗比色法測定全磷含量（鮑士旦，2005）。

1.5 實驗數據處理

運用Microsoft Excel 2010軟件處理數據，采用SPSS17.0軟件中的雙因素方差分析（Two-way ANOVA）檢驗臭氧脅迫程度、脅迫時間及其交互作用對大豆各器官N、P含量及比值的影響，對各器官 N、P含量及比值之間的關系進行 Pearson相關性分析，并采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析不同脅迫程度、不同脅迫時間以及不同器官間N、P含量及比值的差異，結合Duncan檢驗法進行多重比較。各器官N、P含量及比值的變異系數=標準差/平均值×100%，采用最小顯著差異法（LSD）進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 臭氧脅迫對大豆N、P含量及比值的影響

由圖1可知，臭氧脅迫強度與生長時期對大豆根、莖和葉N含量均存在顯著交互作用（P＜0.05）。隨著生育期的延長，根N含量在CK和T2處理中表現為先上升后下降趨勢，T1處理呈逐漸下降的趨勢；莖N含量在CK處理下逐漸下降，T1處理先下降后上升，T2處理趨勢與T1處理相反；葉N含量在CK和T1處理下呈先上升后下降的趨勢，T2處理逐漸下降。隨著臭氧濃度的升高，根N含量在分枝期呈先升高后降低的趨勢，T1和T2處理分別比CK處理高34.06%和15.22%，差異達顯著水平（P＜0.05），開花期呈先降低后升高的趨勢，T1處理比CK處理低7.13%，差異達顯著水平（P＜0.05），T2處理比 CK處理高 17.37%，差異達顯著水平（P＜0.05），結莢期呈逐漸上升的趨勢，T1和T2處理顯著大于CK處理，整個生育期各處理間均存在顯著差異（P＜0.05）；莖 N含量在分枝期和開花期呈逐漸升高的趨勢，結莢期呈先升高后降低的趨勢，3個時期均為T1和T2處理顯著大于CK處理（P＜0.05）；葉片 N含量在分枝期逐漸升高，T2處理比CK處理高20.77%，差異達顯著水平（P＜0.05），開花期呈先升高后降低，T1和T2處理分別比CK處理高10.47%和5.19%，差異達顯著水平（P＜0.05），結莢期逐漸降低，T1和T2處理分別比CK處理高5.39%和17.03%，差異達顯著水平（P＜0.05）。

圖1 臭氧脅迫下大豆N含量的變化Fig. 1 Nitrogen content of soybean in different ozone stress treatments

圖2 臭氧脅迫下大豆P含量的變化Fig. 2 Phosphorus content of soybean in different ozone stress treatments

由圖2可知，臭氧脅迫程度與生長時期對大豆根、莖和葉P含量均存在顯著交互作用（P＜0.05）。隨著生育期的延長，根P含量在CK處理中呈先升高后降低，T1和T2處理均先降低后升高；莖P含量在各處理中均逐漸降低；葉P含量在CK和T1處理中先降低后升高，T2處理先升高后降低。隨著臭氧濃度升高，根P含量在分枝期先升高后降低，T1和T2處理分別比CK處理高29.56%和24.07%，差異達顯著水平（P＜0.05），開花期先降低后升高，T1處理比 CK處理低 15.96%，差異達顯著水平（P＜0.05），T1和 T2處理間存在顯著差異（P＜0.05），結莢期逐漸升高，T1處理和T2處理均顯著高于CK處理（P＜0.05）；莖 P含量在整個生育期均呈逐漸升高的趨勢，分枝期和結莢期T1處理和T2處理顯著高于CK處理（P＜0.05），各處理間均存在顯著差異（P＜0.05），開花期 T2處理顯著高于 CK 處理30.22%（P＜0.05），T1和T2處理間存在顯著差異；葉P含量在分枝期逐漸降低，T2處理比CK處理低25.10%，差異達顯著水平（P＜0.05），T1和 T2處理間存在顯著差異，開花期逐漸升高，T2處理顯著高于 CK處理，結莢期先升高后降低，T2處理比CK處理低11.37%，差異達顯著水平（P＜0.05），各處理間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖3 臭氧脅迫下大豆N、P比值的變化Fig. 3 N/P of soybean in different ozone stress treatments in different drought stress treatments

由圖3可知，臭氧脅迫程度與生長時期對大豆根、莖和葉 N/P均存在顯著交互作用（P＜0.05）。隨著生育期的延長，根N/P在CK和T1處理下均逐漸降低，T2處理先升高后降低；莖N/P在CK和T1處理下均逐漸升高，T2處理先升高后降低；葉片N/P在CK和T1處理下先升高后降低，T2處理逐漸降低。隨著臭氧濃度升高，根N/P在分枝期先升高后降低，T2處理顯著低于CK處理（P＜0.05），T1和T2處理間存在顯著差異（P＜0.05），開花期逐漸升高，T1和T2處理顯著高于CK處理（P＜0.05），結莢期逐漸升高，T2處理顯著高于 CK處理，T1和T2處理間存在顯著差異（P＜0.05）；莖N/P在分枝期和結莢期均先升高后降低，均為 T1處理顯著高于CK處理（P＜0.05），結莢期T1處理和T2處理間存在顯著差異（P＜0.05），開花期逐漸升高，T1和T2處理顯著高于CK處理（P＜0.05）；葉N/P在分枝期逐漸升高，T2處理顯著高于 CK處理（P＜0.05），開花期先升高后降低，T1與T2處理間存在顯著差異（P＜0.05），結莢期先降低后升高，T1和T2處理顯著低于CK處理（P＜0.05）。

2.2 大豆不同器官N、P含量及其比值的相關關系

由表1可知，大豆各器官之間N、P含量和N/P的相關關系不同。根、莖、葉N含量兩兩之間相關性均不顯著，莖P含量與根P含量間呈顯著正相關，莖P含量與根N含量間呈顯著正相關，根和莖的N與P含量之間呈顯著正相關，根和葉的N/P與N含量之間呈顯著正相關，各器官N/P與P含量相關性不顯著。

2.3 臭氧脅迫下大豆不同器官N、P含量及比值的變異特征。

由表2可知，大豆N、P含量和N/P在各器官中的分布規律不同。N含量變化范圍為 7.83－36.82 mg·g-1，表現為葉＞根＞莖，各器官中存在顯著差異（P＜0.05）；P含量變化范圍為 1.47－3.06 mg·g-1，各器官中無顯著差異；N/P變化范圍為4.40－16.85 mg·g-1，表現為葉＞根＞莖。各器官N含量變異系數為12.59%－22.88%，表現為莖＞根＞葉；P含量變異系數為11.26%－19.77%，各器官中變異程度相似；N/P變異系數為4.40%－16.85%，表現為葉＞根＞莖。根和莖N含量的變異系數大于P含量的變異系數，葉中N含量的變異系數和P含量的變異系數相近。

3 討論

3.1 臭氧脅迫下大豆N、P含量及其比值的變化

關于臭氧濃度升高對植物氮磷含量的影響已有相關報道，但結果不盡相同。研究表明，臭氧濃度升高使植物營養元素含量增加（Zhuang et al.，2016）。也有研究表明，臭氧濃度升高使葉片N含量顯著升高，而根和莖N含量沒有顯著變化（Shang et al.，2018）。本研究發現，110 nmol·mol-1對大豆體內N含量影響顯著，但不同器官和不同生育期變化規律不一致。大豆根、莖、葉N含量在生育前期（分枝期和開花期）大于生育后期（結莢期），這是在生育前期大豆處于營養生長階段，大豆體內的物質處于積累時期，生長速率較快，細胞分裂也較快，需要更多的蛋白質來支持，生育后期環境溫度升高，植物代謝率升高，使得植物體內的碳水化合物增多，生物量也快速積累，營養元素受到稀釋（劉洋等，2013），從而使生育后期大豆體內根、莖、葉N含量降低。臭氧濃度升高使根在開花期T1處理和葉片結莢期 N含量顯著降低，其余時期和處理下 N含量均有不同程度的顯著性增加，表明在臭氧脅迫下，大豆會對其產生一種適應，通過增加N含量來提高植物對臭氧的防御能力（Yu et al.，2016），高濃度的N可以通過改變葉片的轉換機制從而提高植物的適應能力，而低濃度的N降低了葉片的修復和防御功能。Dumont et al.（2014）研究表明，植物本身通過能量和抗氧化劑可以使氨基酸轉移，進一步能減弱臭氧對植物的負面影響。同時根系是植物吸收水分和養分的主要器官，莖稈中的 N含量與其代謝速率密切相關（Reich et al.，2008），其大部分用于水分和養分的同化、運輸及儲藏等生理功能，葉片N含量增加有助于提高植物在逆境情況下的防御能力和修復能力，進而提高光合作用；而在結莢期，臭氧脅迫使葉片N含量顯著降低，此結果與陳娟等（2011）研究結果一致，這是由于葉片是光合作用的主要器官，生育后期臭氧濃度升高加速了葉片的衰老，使葉片光合作用降低，從而使葉片N含量降低（Shang et al.，2018）。

表1 大豆不同器官N、P含量及比值的相關系數Table 1 Correlation coefficients among nitrogen, phosphorus content and their ratio of soybean in different organs

表2 大豆N、P含量及比值在各器官的分配特征Table 2 Nitrogen, phosphorus content and their ratio of soybean in different organs

研究表明，臭氧濃度升高使楊樹 P含量增加（Shang et al.，2018）。陳娟等（2011）研究發現臭氧濃度升高使小麥各生育期P累積量明顯降低，成熟期的葉部P質量分數降低，而籽粒P質量分數卻有所增加。Piikki et al.（2006）研究認為，2倍大氣臭氧濃度對土豆（Solanum tuberosum L.）塊莖中的P含量無顯著影響。本研究發現，大豆在對照處理下根P含量在分枝期和開花期大于結莢期，而臭氧濃度升高處理下根P含量在分枝期和結莢期大于開花期，說明大豆吸收P主要在開花期，根是營養吸收的主要通道，而臭氧濃度升高對大豆造成傷害，抑制大豆同化物向根部運輸，使得開花期大豆根P含量降低；莖P含量隨著生育期延長逐漸降低，這是因為莖是連接葉片和根的中間體，對營養吸收很重要，在生育前期大豆處于營養生長階段，體內P含量較多，而生育后期環境溫度逐漸升高，植物代謝率升高，使得植物體內的光合產物增多，營養元素受到稀釋，最終P含量隨著生育期的延長逐漸降低；葉片在對照和較高臭氧濃度下分枝期和結莢期P含量大于開花期，而高濃度下開花期P含量最高，說明在開花期，低濃度臭氧脅迫會降低葉片的修復能力，抑制葉片進行光合作用，使葉片P含量降低，而高濃度臭氧會使大豆產生適應，利用自身的自我修復功能，提高光合作用，最終開花期葉片P含量提高。臭氧濃度升高使大豆根、莖、葉P含量表現出不同程度的明顯增加趨勢，這與 Shang et al.（2018）研究結果相似，P在植物體內參與光合作用、淀粉合成、碳水化合物代謝等一系列的生理過程，當臭氧濃度升高時，大豆生長受到限制，而大豆為了適應臭氧環境，會對營養元素進行選擇性吸收、物質轉化以及傳輸來增加大豆對 P素的吸收與存儲；但在開花期根系 P含量顯著下降，說明臭氧濃度升高對大豆造成傷害，影響植物體內營養元素的運輸，而根是養分傳輸的主要通道，從而使根系P含量顯著降低，葉片P含量在分枝期和結莢期T2處理下顯著降低，這是高濃度臭氧抑制了大豆生長，使大豆葉片受到損傷，光合作用降低，進一步使P含量降低。

生態化學計量學的一個重要應用理論表明，根據植物葉片的 N∶P可以作為判斷環境因素對植物生長的養分供應情況的重要指標（曾德慧等，2005）。Koerselman（1996）通過對沼澤、濕草地和歐石楠（Erica）荒原等生態系統的研究表明，植物體內N/P小于14時，植物生長受N限制，植物組織N/P大于16時，植物生長受P限制，而當植物體內N/P介于14和16之間時，植物生長受N和P共同限制，這個理論被廣泛應用于生態系統限制因子的判斷。本研究中，臭氧濃度升高使根、莖N/P增加，但都小于14，說明隨著臭氧濃度的升高，生長受N元素的限制作用減弱，這可能是臭氧濃度升高影響了土壤N、P含量，植物就會通過增加N含量來提高適應環境的能力，而臭氧抑制了大豆的生長，導致體內P含量降低，所以N/P增加。臭氧濃度升高使分枝期葉片 N/P逐漸增加，CK和 T1處理N/P＜14，T2處理N/P＞16，開花期葉片CK和T1處理 14＜N/P＜16，T2處理 N/P＜14，說明臭氧濃度升高加強了分枝期P素和開花期N素對大豆葉片生長的限制；結莢期葉片N/P降低，N/P＜14，說明隨著臭氧濃度的升高，葉片生長受N元素的限制作用加強，這可能是臭氧濃度升高使土壤N、P有效性降低，從而影響光合作用，以及大豆的固氮能力下降，而植物為了適應環境就會在吸收、同化和運輸等方面增加對N素的消耗，同時臭氧抑制了大豆生長以及生育后期葉片衰老，導致對P的消耗降低，所以N/P下降。

3.2 臭氧脅迫對大豆不同器官N、P含量及比值相關關系的影響

N、P作為植物生長的限制因素，對植物各器官N、P含量及比值進行相關性分析，可以全面了解植物對環境的適應機制（Yuan et al.，2011）。本研究表明，大豆在臭氧脅迫下，大豆各器官間的N含量彼此之間相關不顯著，而根和莖的P含量之間呈顯著正相關，說明大豆在臭氧脅迫下，根和莖間的P存在較強的協變性，P在根和莖中彼此協調適應環境。研究還發現根和葉的N/P與N含量之間也呈正相關顯著，這也進一步說明臭氧脅迫使大豆在生長過程中根和葉受N的限制作用較強；莖P含量與根N含量間呈正顯著相關，因為P是合成富含N的蛋白質rRNA的主要成分（Agren，2008），而莖又是連接葉片和根的重要營養傳輸器官（Zhao et al.，2016）。本研究中，根和莖中的N和P含量之間有正顯著相關，而葉片中N含量和P含量之間相關不顯著，這與平川（2014）研究結果不同，這可能是因為本試驗中存在某一種元素缺乏或供應太多的現象，使得葉片之間N、P的失衡，也有可能是本實驗的研究手段與前人不同，以及試驗過程中溫度與土壤等方面存在差異。本試驗采用盆栽試驗，嚴格控制試驗期間的水分和肥料，使其均勻一致，得出結果說明臭氧濃度升高使大豆各器官N、P元素呈現不同的變化趨勢，導致根系和莖稈中N和P元素呈相關顯著，而葉片中N、P元素之間相關不顯著。

3.3 大豆不同器官N、P含量及比值的變異特征對臭氧脅迫的響應

根、莖、葉作為植物體內不同的營養器官，因其結構功能的不同，各器官中的N、P含量也不同，所以同一植物不同器官的N、P含量和N/P也不同（賀合亮等，2017）。本研究發現，臭氧脅迫下大豆N含量和N/P在各器官中的順序為葉＞根＞莖，P含量在各器官中無顯著差異，這可能是葉片和細根分別是植物體內的同化器官和吸收器官，其N、P含量通常較高（印婧婧等，2009），而臭氧濃度升高使莖P含量顯著升高，導致P含量在各器官中無顯著差異。本研究還發現，臭氧濃度升高各器官 N含量的變異系數為12.59%－22.88%，P含量變異系數為11.26%－19.77%，說明臭氧脅迫對大豆N、P的吸收影響程度不同，而且在不同器官中的變異性也不同。N在根和莖中的變異程度大于P，葉中N和P變異性相似。臭氧脅迫使N在不同器官中的變異程度為莖＞根＞葉，說明莖稈對臭氧脅迫最敏感，臭氧嚴重影響了其對營養物質的傳輸和吸收等功能。

4 結論

綜上所述，臭氧濃度升高影響大豆各器官N分配，N供給葉片多于根系，供給莖稈最少，而P在各器官中的供給無顯著差異。隨著臭氧濃度升高和大豆生育期的延長，大豆各器官N/P值小于14，說明大豆生長主要受N限制。研究結果可為近地層臭氧濃度升高條件下，合理施用氮（磷）肥以提高大豆生產力提供理論依據。