PNPLA3基因多態性與酒精性肝病發生的關系

2019-04-08 06:27:28陳攀麗唐建榮付雪芹

肝臟 2019年3期

陳攀麗唐建榮付雪芹

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)發病率可達283～493萬人左右[1]，臨床上ALD的發生能夠導致患者多器官功能衰竭的發生，增加患者的死亡風險[2]。PNPLA3基因位點rs738409多態性的改變能夠通過對于局部肝臟上皮細胞微環境的改變，誘導趨化因子和補體成分的激活，進而導致肝臟小葉結構的損傷。PNPLA3基因位點多態性還能夠通過增加肝臟上皮細胞對于酒精的代謝障礙，導致酒精的蓄積效應明顯增強，加劇了酒精對于肝臟上皮細胞的損傷[3]。部分研究者探討了PNPLA3基因多態性與消化系統惡性腫瘤的關系，認為PNPLA3基因多態性能夠導致腫瘤易感性的明顯上升，同時還能夠降低腫瘤放化療治療的敏感性[4-5]，但關于PNPLA3基因多態性與ALD的關系研究不足。本研究選取2016年1月至2018年2月在我院治療的ALD患者140例，探討了PNPLA3基因位點rs738409多態性與ALD的關系，報道如下。

資料和方法

一、一般資料

選取2016年1月至2018年2月在我院治療的ALD患者140例(ALD組)，同時選取嗜酒者但未診斷ALD志愿者100例(嗜酒組)和不飲酒健康志愿者100例(對照組)作為對照。納入標準：(1)診斷符合《酒精性肝病診療指南》中的標準；(2)嗜酒組符合：有強烈的飲酒渴求、發作時間固定，不飲酒時出現生理和心理癥狀，同時B超、肝功能等檢查無異常；(3)患者及家屬對本研究知情同意。排除標準：(1)合并有病毒性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病等；(2)合并有惡性腫瘤，心、肺等重要臟器功能不全等。

二、實驗方法

PNPLA3基因多態性的檢測：取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進行分離，每1 mL TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2 mL氯仿，進行裂解操作，4 ℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。加逆轉錄酶后， 37 ℃孵育60 min生成cDNA。進行PCR產物擴增，反應設置為：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、55 ℃ 2 min，共40個RT-PCR循環。

采用羅氏檢測公司生產的multipical多態性檢測試劑盒，在相應的位點進行單堿基的序列檢測。使用ABI1310進行PCR跑膠電泳，儀器購自美國Life Technologies公司，采用GENEMAPPER軟件進行對比分析，儀器購自美國Life Technologies公司。

采集入院后靜脈血，離心后收集上清液，采用免疫發光法檢測血清中PCⅢ和ⅣC水平，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標儀，檢測試劑盒購自南京凱基生物制劑有限公司；采用全自動生化法檢測AST、ALT和GGT值，配套試劑購自南京凱基生物制劑有限公司。

三、統計學處理

統計分析采用SPSS19.0軟件，計量資料采用(均數±標準差)表示，3組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較使用卡方檢驗；采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗樣本群體代表性。檢驗水準α=0.05。

結果

一、各組受試者一般特征比較

對照組、嗜酒組和ALD組性別、年齡等一般特征比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組一般特征比較

二、基因多態性檢測

PNPLA3基因位點rs738409存在C/G突變，得到3種基因型，分別為CC型、GC型、GG型，見圖1。

圖1 PNPLA3基因酶切電泳圖

1：GG型；2：CG型；3，4,5,7,8，9：CC型；M：Marker

三、各組PNPLA3基因型及等位基因比較

對照組、嗜酒組和ALD組PNPLA3基因多態型符合Hardy-Weinberg平衡定律；ALD組基因型GG型和等位基因G的比例為18.57%和39.29%，明顯高于對照組和嗜酒組(χ2=6.586和4.290，10.714和8.504，P<0.05)。見表2。

四、 ALD組不同基因型患者AST、ALT等比較

GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明顯高于CC型和CG型(P<0.05)。見表3。

討論

ALD的發生率有逐漸上升的趨勢，特別是在有自身免疫力紊亂的人群中，ALD發生風險更高，肝功能衰竭的風險更大[6]。ALD的發生不僅能夠導致肝臟上皮細胞代謝和內分泌功能障礙，同時還能夠增加遠期惡性消化道病變的發生風險，增加肝癌和膽囊癌等的發生幾率[7-8]。

PNPLA3基因rs738409位點的改變能夠誘導單核細胞過度激活，提高了中性粒細胞對于肝臟上皮組織的損傷程度。rs738409位點的改變能夠通過影響PNPLA3的轉錄和翻譯，導致下游炎癥因子的激活，增加了腫瘤壞死因子α對于肝臟小葉結構或者小葉導管的破壞作用。基礎研究還認為，PNPLA3基因rs738409位點的改變能夠加劇T淋巴細胞的自身免疫性損傷，降低肝臟上皮細胞對于高負荷酒精的耐受程度，導致肝臟上皮細胞的變性程度明顯增加[9]。

由于體質指數、飲酒量等因素可能在一定程度上影響基因多態性的結果，本研究對于不同組別患者的一般臨床資料分析表明，不同組在體質指數、年齡、飲酒量等方面并無明顯的差異，排除了相關因素對于統計學結果的影響，體現了本研究的科學性。等位基因的分析顯示，主要以CC型、GC型、GG型為主，其中ALD組基因型GG型和等位基因G明顯高于對照組和嗜酒組，差異較明顯，提示了基因型GG型和等位基因G對于ALD的發生可能具有顯著的促進作用。這主要與以下幾個方面的病理作用有關：(1)基因型GG型和等位基因G的上升能夠導致PNPLA3轉錄活性的增強，誘導肝臟上皮細胞膜修復能力下降，在持續性較高乙醇濃度的損傷下，肝臟上皮細胞的持續性凋亡更顯著；(2)基因型GG或者等位基因G的上升能夠導致肝臟上皮細胞線粒體功能的不足，影響到上皮細胞的能量利用，導致其對于乙醇的代謝和分解能力明顯下降。王健等[10]研究者也探討了基因多態性與肝病的關系，發現在肝病小鼠模型中，PNPLA3基因多態性的比例可平均上升30%以上。PCⅢ和ⅣC是評估肝臟纖維化的指標，本研究中GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明顯高于CC型和CG型，提示GG基因型的ALD患者肝臟纖維化改變更明顯。這主要由于基因型GG型能夠導致肝臟上皮間質中成纖維細胞的成熟，并誘導氧化應激反應的發生，促進肝臟病變的持續性進展。 AST、ALT和GGT是評估患者肝功能的指標，本研究中并未發現GG基因型與AST、ALT和GGT的關系，提示基因多態性并不能顯著影響肝功能水平。