黃芩素對肥胖小鼠體脂及胰島素抵抗的作用研究

陳美珍，陳簡慶，吳紅蓮

（恩平市人民醫院內分泌科，廣東恩平 529400）

隨著社會生活水平的提高，生活方式的改變，老齡人口增加等，腹型肥胖人群越來越多?，F大量有關代謝綜合征的研究均提示腹型肥胖和胰島素抵抗是其發生、發展過程中的兩個起最大突出作用的危險因素。肥胖時，機體脂肪增多，而又以內臟脂肪增加更為顯著[1-2]。在肥胖患者，體內脂肪的蓄積導致大量非酯化游離脂肪酸（nonesterified fatty acids）大量釋放，進入血循環后，可作用胰島素靶器官（肝臟、脂肪組織、骨骼肌），導致胰島素抵抗形成。脂肪組織不僅是能量儲存庫，而且更是一個具有旁分泌、自分泌功能的內分泌器官。它可以分泌大量前炎癥因子和脂源性的細胞因子（如脂聯素）參與胰島素抵抗形成和糖耐量異常的發生過程。但是，代謝綜合征定義尚未一致，同時其病情復雜，發病機理不明確，深入研究發病機制，可為臨床防治提供有益參考。近年來發現天然化合物具有多種藥理作用，遠較單一化合物作用廣泛，因此對天然化合物的開發和研究成為熱點，尤其是天然化合物在心血管領域的研究更為火熱。有關藥物研究顯示，黃芩素是黃酮類的化合物，是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有如抗炎、清除氧自由基和保護心腦血管等多種藥理作用[3-4]。本實驗研究采用高脂飼料誘導C57BL/6 小鼠29 周，建立代謝綜合征疾病模型。從個體體重，肝臟、內臟脂肪重量增加等方面評價小鼠肥胖狀態；用糖耐量實驗、胰島素耐量實驗來評價小鼠機體組織糖耐量降低，胰島素敏感性下降改變；檢測血脂評價小鼠脂代謝紊亂；病理組織形態學顯示小鼠肝臟脂肪空泡變性等方面揭示代謝綜合征疾病特征。同時從飼料中添加天然化合物黃芩素進行干預對比研究，觀察并分析黃芩素對代謝綜合征的可能保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：9 周齡，C57BL/6 小鼠的雄性小鼠120只，購自廣東醫學院實驗動物研究所動物中心。所有實驗小鼠飼養于廣東醫學院SPF 級動物房。溫度24±2 ℃，濕度40%～70%，每12 h交替照明,自由飲水進食。

動物飼料主要成分：AIN-76A 標準飼料（脂肪5.2，蛋白質17.7，碳水化合物64.9）；PAIGEN 高脂飼料（脂肪15.8%，膽固醇1.25%，膽酸鈉0.5%，玉米油1%）；AIN-76A 標準飼料添加中藥黃芩素，藥物濃度為0.5；PAIGEN 高脂飼料添加中藥黃芩素，藥物濃度為0.5。所有飼料均由中國醫學科學院實驗動物研究所動物中心合成，經鈷60 照射處理，密封后冰箱保存。

實驗所需藥物及試劑：黃芩素粉劑（上海融禾醫藥科技發展有限公司）；檸檬酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；中性胰島素注射液（400 IU/10mL/支）（丹麥諾和諾德公司）；10%醫用葡萄糖注射液（上海百特醫療用品有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業有限公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

實驗動物分組：10 周齡,雄性C57BL/6 小鼠,共120只。采用高脂飼料誘導，建立C57BL/6 小鼠代謝綜合征模型。并給予中藥黃芩素干預，進行對比觀察和研究。實驗動物具體分組如下：HFD 組(high fat diet group),給予PAIGEN 高脂飼料；HFD+0.5%Bacalein 組，給予已添加0.5%黃芩素的PAIGEN 高脂飼料飼養；NC 組（normal rodent chow group），用AIN-76A 標準飼料飼養；NC+0.5%Bacalein 組，給予已添加0.5% 黃芩素的AIN-76A 標準飼料飼養。以上各組C57BL/6 小鼠均為30只。

動物飼養及終點取材：C57BL/6 小鼠于室溫24±2 ℃,濕度40%～70%喂養，自由飲水攝食。所有小鼠先普通飼料適應性飼養l 周，從小鼠第十周齡開始，按實驗動物分組開始正規投食，每周一次稱量小鼠食量；在實驗開始6 周內，每周均測量記錄小鼠體重，以后每兩周稱量一次小鼠體重，直至小鼠喂養至29 周。在實驗第23、24 周，小鼠禁食6 h后，分別行小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT）、腹腔注射胰島素耐量試驗（IPITT)，評價小鼠胰島素抵抗。第29 周末小鼠在禁食8 h后，先稱量體重，采用無水乙醚吸入法麻醉小鼠，Fisher 毛細玻璃采血管經眼眶后靜脈叢刺入，采血約1.2 mL 室溫下靜置1～2 h，使血液自然凝固。4 ℃高速離心機離心分離血清，一部分血清送本院檢驗科檢測血脂。在采血完畢后迅速頸椎脫臼法處死小鼠，快速分離出小鼠全部肝臟，PBS 溶液漂洗血液，用無菌紗布蘸干肝臟表面的液體后置于天平上稱量肝臟重量。同時按肝臟重量（g）/小鼠體重（g）×100，計算出肝臟指數。將肝組織在10%福爾馬林溶液中固定24 h，逐級脫水，石蠟包埋制成5 μm 切片，行HE 染色，以觀察肝臟脂肪病變情況。仔細完全分離出腸系膜、雙側腎周圍及雙側睪丸附近的白色脂肪組織，置于天平上稱量白色脂肪組織重量。同時按白色脂肪組織重量（g）/小鼠體重（g）×100，計算出脂肪指數。

1.3 數據統計學處理

采用SPSS16.0 統計軟件進行數據統計處理,計量資料以均數±標準差（±s）表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高脂飼料飼養組小鼠肥胖狀態及血脂紊亂

2.1.1 小鼠體重動態變化

從實驗第5 周開始，與HFD 組比較，HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠體重輕，差異有統計學意義（P＜0.05）；且一直保持至實驗終末，未添加藥物的高脂飼料飼養小鼠明顯肥胖，見圖1。

圖1 小鼠體重動態變化

2.1.2 小鼠腹圍、Lee’s 指數比較

各組小鼠腹圍比較差異無統計學意義，說明外周脂肪的增長并不與代謝綜合征成平行相關。而小鼠Lee’s 指數比較，反映了HFD 組小鼠較為顯著的肥胖狀態，見表1。

表1 小鼠腹圍、Lee’s 指數比較

2.1.3 小鼠肝臟指數、內臟脂肪指數比較

黃芩素可以降低高脂引起的肝臟重量增加，表現了良好的肝臟保護作用，黃芩素顯著降低內臟脂肪，減輕肥胖癥狀，見表2。

表2 小鼠肝臟指數、內臟脂肪指數比較（%）

2.1.4 小鼠血脂檢測

從血脂檢測結果來看，黃芩素可以有效降低血總膽固醇和低密度脂蛋白濃度（P＜0.01），見表3。

表3 小鼠血脂（TC、LDL-C）檢測（mmol/l）

2.2 高脂飼料飼養組小鼠糖耐量調節受損和胰島素抵抗

2.2.1 空腹血糖（Fasting Blood Glucose,FBG）

空腹血糖檢測比較發現，HFD 組小鼠血糖水平與HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠血糖水平無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 四組小鼠空腹血糖比較

2.2.2 小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗（Intraperitoneal injection of glucose tolerance test，IPGTT)

與HFD 組小鼠比較，HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠在加入黃芩素干預后可以明顯改善由長期高脂飲食引起的胰島素抵抗狀態，增強其糖耐量能力，曲線下面積（AUC）降低15.36%（P＜0.001），見表5。

表5 四組小鼠IPGTT曲線下面積（AUC）比較（mmol.min/l）

2.2.3 小鼠腹腔注射胰島素耐量試驗（Intraperitoneal injection of insulin tolerance test，IPITT)

HFD 組與HFD＋0.5%Bacalein 組相比較，前組小鼠對外源胰島素的敏感性明顯降低，但加入黃芩素干預后可以明顯改善由長期高脂飲食引起的胰島素抵抗狀態，增加對胰島素的敏感性，其曲線下面積（AUC）降低31.6%（P＜0.001），見表6。

表6 四組小鼠IPGTT 曲線下面積（AUC）比較

2.3 HE 染色顯示模型組小鼠肝臟組織脂肪變性

HFD 組小鼠肝臟HE 染色顯示，肝細胞脂肪脂滴浸潤，發生明顯的空泡化，脂滴空泡融合成片狀，細胞核破壞成散碎片狀，著色淺。根據肝臟脂肪病變判斷標準，評估HFD 組小鼠的肝臟脂肪變性等級為3 級，約55%～60%的肝細胞發生了明顯脂肪變性。高脂飲食組小鼠的肝臟脂肪空泡變較HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠肝臟變化非常明顯，后組小鼠肝臟細胞形態完好，僅少量細胞有脂肪變性，胞核完整，染色較深，這充分說明了黃芩素在保護肝細胞免受脂肪毒害有重要作用。而NC 組及NC+0.5%Bacalein 組之間比較無明顯異常，也充分說明了黃芩素藥物本身對小鼠肝臟是沒有毒性作用的。

3 討論

代謝綜合征是一種表現復雜的臨床綜合征，主要包括胰島素抵抗、腹型肥胖（或稱中心型肥胖、內臟型肥胖）、血脂異常、高血壓、非酒精性脂肪肝病等。本研究認識到在所有相關危險因素中，異常肥胖（尤其是腹型肥胖）、胰島素抵抗是與代謝綜合征發生發展有關的、兩個主要的危險因素?，F代社會物質生活水平的提高、生產工作方式極度轉變，肥胖人群數量劇增，再加上老齡人群的不斷擴大，同時，流行病學顯示代謝綜合征患者的心血管疾病、2 型糖尿病的發生率分別是正常人的2 倍，5倍[5]，可見其防治愈顯關鍵。但由于其病情復雜，發病機制在當前研究尚未明確，因此深入研究十分必要。本實驗動物疾病模型是完全采用長期高脂飼養誘導下建立的，其疾病形成類似人類在自然狀態下發生。結果顯示，實驗小鼠在喂養29 周后，高脂飼料飼養組小鼠肥胖狀態非常明顯，其終末體重為（40.95±1.03）g,內臟脂肪重量（3.26±0.26）g，而高脂飼料添加黃芩素飼養組小鼠，其終末體重為（35.87±0.93）g,內臟脂肪重量（1.94±0.17）g。兩組小鼠終末體重，內臟脂肪重量比較差異非常顯著（P＜0.01）。說明了黃芩素有效對抗高脂飲食引起的肥胖，減少內臟脂肪形成。

圖2 各組小鼠第26 周肝臟行染色后的病變變化情況(HE×200)

許多臨床和研究證據證實[6-7]，腹部脂肪堆積、增多導致各種代謝異常，如糖耐量異常、高血脂。同時，腹型肥胖和胰島素抵抗與高血壓、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝（NAFLD）發生密切相關。因此有人指出，腹型肥胖是代謝綜合征的重要起始因子。

小鼠在長期高脂飲食的誘導下是否發生糖耐量異常和胰島素抵抗，本實驗行糖耐量和胰島素耐量實驗進一步證實和評估?？崭寡潜容^，HFD 組小鼠血糖水平低于HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠（P＜0.05）。推測與禁食時間較長（6 h），由于HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠肝臟病變較輕，不存在肝臟糖原合成、儲備功能障礙。當饑餓時，大量的肝臟糖原可以及時代償性的大量釋放，引起血糖上升，而HFD 組小鼠存在脂肪肝?。ㄔ诟闻K組織形態學HE染色已得到證實），糖原合成、儲備減少所致。IPGTT 及血糖曲線下面積（AUC）結果顯示，高脂組小鼠血糖值明顯高于其他各組，且血糖峰值在腹腔注射葡萄糖液15 min 后出現，在實驗第120 min，標準飲食組及加黃芩素干預組小鼠血糖均已降低至空腹前水平，但此時高脂飲食組小鼠由于明顯的血糖耐量受損而血糖值下降延遲,加黃芩素干預的高脂飲食組小鼠血糖曲線下面積（AUC）降低15.36%(P＜0.001)，可見，黃芩素有效調節血糖代謝，明顯改善糖耐量。IPITT 結果與糖耐量實驗結果相對應，高脂飲食組及加黃芩素干預組小鼠血糖值也均高于標準飲食組及加黃芩素干預組，前兩組小鼠血糖曲線谷值處在30 min時，在實驗2 h后，兩組小鼠血糖值均高于空腹基礎血糖水平，表明均存在胰島素抵抗。但高脂飲食加黃芩素干預組血糖值，血糖曲線下面積均低于單純高脂飼養組(P＜0.001)，充分說明小鼠糖耐量調節受損存在，胰島素抵抗明顯。說明黃芩素也較好地改善了胰島素抵抗。

在高脂飲食或肥胖時，胞外信號和胞內刺激如氧化應激[8]，內質網應激等均可以激活IKKβ/NF-kB信號通路，促進炎癥因子的產生及釋放增加[9]。而炎癥因子TNF-α、IL-6 等可通過作用于胰島素受體底物絲氨酸磷酸化，也就相應的阻止了正常情況下的酪氨酸磷酸化而使胰島素PI3-K 這條代謝通路受損，促成胰島素抵抗[10]。此外，大量脂肪組織釋放出FFAs 入血，由于高濃度的血清FFAs 可增強葡萄糖6-磷酸酶活性，抑制了肝臟糖原的合成、儲備，還可作用于胰島素代謝通路，影響肝臟葡萄糖內攝，導致輸出增加。這在胰島素的另一靶組織骨骼肌也同樣產生胰島素抵抗[11-12]。

對于黃芩素改善胰島素抵抗，調節血糖耐量保護作用，這可能與它改善高脂引起的游離脂肪酸、前炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等大量釋放，促進具保護性的脂聯素合成、分泌，拮抗胰島素的靶器官胰島素抵抗有關。黃芩素是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有多種藥理作用，如抗炎、清除氧自由基和保護心腦血管等作用[13]。盡管現沒有查閱到任何黃芩素在代謝綜合征中的抗炎研究，但是在慢性炎癥或腦創傷，急性胰腺炎等[14-15]研究中，通過有效降低TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子，均顯示了強大的抗炎效應和保護作用。因此，本研究推測黃芩素很有可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子表達發揮改善胰島素抵抗效應，并調節異常血糖代謝。

高脂或肥胖時，隨著大量脂肪組織引起的游離脂肪酸大量釋放。在肝臟，游離脂肪酸導致葡萄糖，甘油三酯和VLDL 的分泌增加以及包括HDL-C 減少和LDL 增加在內的脂質，脂蛋白異常。本實驗血脂檢測結果顯示，高脂飼料飼養組小鼠TC,LDL-C水平明顯高于高脂飼料飼養加黃芩素組（P＜0.01），提示小鼠血脂紊亂顯著。病理形態學觀察進一步也證實了血脂檢測結果的可靠性，高脂飼料飼養組小鼠肝臟組織HE 染色顯示，肝細胞脂肪脂滴浸潤，發生明顯的空泡化，成片狀脂肪空泡，細胞核破壞成散碎片狀，著色淺。而加黃芩素的高脂飼料飼養組小鼠肝臟細胞形態完好，僅少量細胞有脂肪變性，胞核完整，染色較深。黃芩素對抗高脂的肝臟毒性作用，推測可能主要與它本身具有抗脂質氧化的能力相關。有研究報道，黃芩素能夠抑制大鼠肝臟微粒體，線粒體內的鐵依耐的脂質過氧化，能保護磷脂酰膽堿脂質體膜免受脂質氧化損傷。而且進步研究分析提示，黃芩素是脂氧合酶抑制劑，其抗氧化能力主要與A,C 環上的羥基集團的數量和位置有關。此外有研究報道[2]，黃芩素通過下調PDGF-β 受體，可以抑制肝臟星形細胞的激活及增殖，可在非酒精性肝病終末期肝硬化形成過程發揮抗纖維化，保護肝臟作用。

4 結論

本研究用高脂飼料飼養誘導C57BL/6 小鼠，形成典型的腹型肥胖；機體組織糖耐量下降，胰島素敏感性顯著降低，明顯的糖、脂代謝紊亂；病理組織形態學提示肝臟發生顯著脂肪空泡變性，呈非酒精性脂肪肝病病變等，揭示了代謝綜合征的基本特征，同時運用黃芩素進行干預對比研究，對代謝綜合征作用顯示了較強的保護作用，其保護作用可能就是圍繞以下兩個方面展開:①黃芩素作用于環氧化酶和抑制炎癥信號通路中樞NF-KB 途徑，減少炎癥因子TNF-α,IL-1β、IL-6 等產生和釋放，顯示了強大的抗炎效應，也就很好的改善胰島素抵抗狀態，有效減輕肥胖；②黃芩素可以有效清除大量內臟脂肪堆積形成的ROS、自由基及抑制游離脂肪酸釋放，調節糖代謝，增強胰島素靶器官的胰島素敏感性。