蛭龍活血通瘀膠囊聯合阿托伐他汀鈣對家兔頸動脈粥樣硬化斑塊的組織學影響

劉孟楠，楊思進，劉 平，羅 鋼，胡鐘競，韓 梅，劉佳利

（西南醫科大學附屬中醫院心腦病科，四川瀘州 646000）

高脂血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的重要致病因素之一，AS 是誘發腦梗死、冠心病等心腦血管疾病的主要原因[1]。高脂血癥患者通常伴有不同程度的頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS），目前的研究大多認為CAS可以作為反映全身AS 病變的“窗口”[2]。AS 形成機制的研究主要圍繞脂質浸潤、內皮細胞損傷、炎癥等方面展開[3]。蛭龍活血通瘀膠囊是楊思進教授提出的采用“補氣、通絡、祛風”為基本療法并經多年臨床實踐形成的中藥復方制劑，該藥物在用于治療冠心病、缺血性腦病等方具有良好的臨床實效[4]。本實驗主要探究蛭龍活血通瘀膠囊聯合阿托伐他汀鈣對家兔頸CAS的組織學影響。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及動物模型建立

清潔級新西蘭大白兔45只，體重1.6～2.2 Kg，由西南醫科大學動物實驗中心提供。存放于西南醫科大學動物實驗中心，光照12 h/d，室溫19～22 ℃，濕度40%～60%飼養。普通飼料適應性喂養1 周，按隨機數字表法分為5組，即對照組（Control）、模型組（Model）、蛭龍活血通瘀膠囊組（ZL）、阿托伐他汀鈣組（Atorva）及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀鈣組（ZL+Atorva）。對照組繼續正常喂養，余組術前12 h禁食，不禁水，麻醉、頸部脫毛并清潔消毒后，作頸正中切皮，于甲狀軟骨上方分離左側長約2.5 cm的頸總動脈。用動脈夾阻斷頸總動脈兩端血流，4.5號頭皮針于血管縱軸方向穿刺進入阻斷血管的兩端，生理鹽水沖洗置換出管腔內的血液后，接上已調節好流量為250 mL/min 的氣流，歷時5 min 干燥內皮，然后將管腔內充滿生理鹽水并恢復血供。濕潤棉片輕壓止血后縫合皮膚創口并包扎。術后肌注慶大霉素預防感染，繼續高脂飼料喂養4 周建立兔CAS 模型[5]。單籠喂飼，飲水不限，每日每只進食150 g飼料。蛭龍活血通瘀膠囊成人的用量4.8 g/d，體重按60 kg計算，換算為動物高劑量為3.12 g生藥/kg/d，為成人用量6 倍，批準文號：川藥字Z20070528，由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑中心提供。阿托伐他汀鈣片組0.51 mg/kg/d，為臨床成人用量的3 倍，批準文號：國藥準字H20093819，北京嘉林藥業有限公司[6]。灌胃體積均為4 mL/kg，共4周。實驗過程中，各組未出現厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物副作用的表現及突發的急性死亡。

1.2 超聲檢查

使用日立HI VISION Ascendus彩色多普勒超聲診斷儀，選擇頻率為8 MHz 高頻線陣探頭，經麻醉、頸部脫毛清潔消毒后將家兔呈仰臥位并四肢固定于實驗操作臺，頭偏向非檢查側，自頸動脈起始部做縱向探查。管腔、內膜面到中膜與外膜交界最大的垂直距離即為頸動脈厚度（intima-media thickness，IMT）數值。以兩側頸動脈IMT 平均數作為最終結果，IMT＜0.2 mm 判斷為正常值；本研究將IMT ≥0.5 mm高回聲或強回聲判斷為實驗兔頸動脈斑塊形成[7]。頸動脈內膜與血液交界所圍繞的管腔橫斷面積為管腔面積(lumen area，LA)。

1.3 油紅O脂肪染色組織學檢查

造模后第4周末取實驗兔頸動脈組織，分離1cm長的頸動脈組織，經脫水透明、浸蠟、包埋并制成厚10 μm的石蠟切片。將切片水洗干燥后入50%乙醇稍洗行油紅O乙醇染液作用，60%乙醇分化，自來水終止分化，蘇木素復染核，水沖洗返藍，甘油明膠封片。400倍顯微鏡下觀察組織情況。

1.4 統計與分析

運用GraphPad Prism 8軟件進行統計作圖，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物頸動脈內中膜厚度及頸動脈斑塊數量

圖1 示，造模后第4 周，與Control 組比較，余組頸動脈斑塊數量均明顯升高、IMT明顯增厚，差異具有統計學意義（P＜0.01），提示高脂血癥CAS模型造模成功。與Model 組比較，各用藥組斑塊數量、IMT均明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與Atorva 組比較，ZL 組抑制斑塊數量及IMT 的作用較弱，差異具有統計學意義（P＜0.05），ZL+Atorva組抑制斑塊數量及IMT 的效果更為顯著，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 實驗動物頸動脈內中膜厚度及頸動脈斑塊數量

2.2 實驗動物頸動脈管腔面積

與Model 組比較，Atorva 組及ZL+Atorva 組管腔面積均有所下降，差異具有統計學意義（P＜0.01），ZL 組的管腔面積變化差異無統計學意義（P＞0.05）；與Atorva 組比較，ZL 組控制管腔面積作用的差異無統計學意義（P＞0.05），ZL+Atorva 組的效果作用差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 實驗動物頸動脈管腔面積

2.3 病理學檢查

如圖3 所示，Control 組未見紅染的脂質條紋及斑塊；Model 組中有大量的紅染斑塊，血管內膜及中膜脂質含量明顯增加；經治療后，ZL 組、Atorva 組和ZL+Atorva組紅染斑塊減少，頸動脈內膜及中膜的脂質含量均有所改善，中膜改善最為明顯，用藥組中ZL+Atorva組內中膜紅染斑塊較少，癥狀最輕。

圖3 高脂血癥動脈粥樣硬化家兔模型的組織學改變(油紅O染色，×400)

3 討論

高脂血癥是導致AS發生的重要危險因素之一，可引起血漿脂蛋白異常，導致動脈管壁發生病變[8]。目前有研究表明，在高脂血癥的情況下，血液中及血管內膜下的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）被運輸到內皮下間隙氧化修飾，形成氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)[3]。一方面Ox-LDL形成后，內皮細胞的滲透性增高，導致脂質更容易沉積于血管內膜[9]；另一方面巨噬細胞被Ox-LDL 激活，通過吞噬作用快速增殖并聚集退化進而凋亡成為泡沫細胞，泡沫細胞大量聚集在血管內中膜故形成AS脂質斑塊[10]。斑塊形成是AS的主要表現之一，與IMT、LA及動脈彈性功能一樣，均是AS的早期評價指標[11-13]。IMT在臨床中可體現高血壓靶器官損害程度、高脂血癥對血管損傷的程度，為高血壓及高脂血癥臨床干預提供依據[14-15]，但相比于IMT 增厚，斑塊形成對心腦血管疾病具有更好的相關性和更高的預測價值[16]。有研究證實，高脂血癥CAS家兔血管內皮變性、增殖、管腔面積增大引起血管壁增厚彈性減退，在高脂血癥環境下頸動脈彈性減低更明顯且血管結構的變化表現為頸動脈IMT增厚[7]。

在本研究的實驗設計中，鑒于家兔頸動脈位置表淺，因此易應用超聲對頸動脈進行測量。實驗開始，所有實驗兔內膜線光滑、整齊，未檢測到明顯的IMT 增厚、斑塊形成及LA 變化，故未納入結果統計進行對比。本研究第5 周行彩超發現Model 組及各用藥組實驗動物頸動脈、IMT均較正常組顯著增厚，提示造模成功，而各用藥組IMT 及斑塊數量較對照組均顯著下降，且蛭龍活血通瘀膠囊與阿托伐他汀鈣聯用效果更佳。本實驗末行頸動脈組織油紅染色可見除對照物外，余組均有大量被紅染的脂質沉積于內中膜，對比各用藥組可發現將蛭龍活血通瘀膠囊與阿托伐他汀鈣聯用可更為有效的降低脂質在血管內中膜的沉積，從而起到抑制斑塊生成的作用。

蛭龍活血通瘀膠囊是由水蛭、地龍、黃芪、桂枝、大血藤等中藥組成的復方制劑，該藥物自面世以來在長期的基礎實驗研究和臨床應用中取得了優良的效果[4]。白雪等[17]的研究證實蛭龍活血通瘀膠囊能夠減少頸動脈狹窄患者斑塊生成及提高斑塊的穩定性，在另一臨床觀察中還得出結論，蛭龍活血通瘀膠囊聯合辛伐他汀能顯著改善高血壓CAS患者中醫臨床癥狀，降低IMT、抑制斑塊生成[18]，本研究的結果與該藥物的相關前期研究結果的趨勢是一致的。

4 結論

本實驗證實，以”益氣、祛風、通絡”為治療原則的蛭龍活血通瘀膠囊聯合阿托伐他汀鈣能夠更有效的降低脂質在頸動脈內中膜的沉積，降低IMT，抑制頸動脈斑塊生成及降低頸動脈LA從而改善AS。